光触发酸驱动配位转换增强活性氧的Fe-多酚聚合物用于肿瘤治疗

本综述系统探讨了光响应性铁-多酚配位聚合物（FeBPs）通过酸驱动配位转换机制增强活性氧（ROS）生成的新策略。研究创新性地整合Fe中心、Bodipy光酸发生器（PAGs）和PEG稳定多酚配体，利用630 nm光照触发局部酸化，促使Fe3+/Fe2+高效转换，显著提升芬顿反应（Fenton）效率。该工作突破了肿瘤微环境（TME）中pH依赖性和铁价态转换缓慢的双重限制，为金属-配体协同治疗提供了新范式。

　　

引言：活性氧治疗策略的挑战与机遇

活性氧（ROS）介导的肿瘤治疗策略通过外源或内源性物质催化氧化反应，诱导细胞内氧化应激，对生物分子造成不可逆损伤并触发细胞凋亡。铁基芬顿试剂因其优异的选择性成为有前景的候选者，但其治疗潜力受限于肿瘤微环境中低效的Fe³⁺/Fe²⁺转换。芬顿反应的内在局限性在于Fe³⁺还原为Fe²⁺的速率缓慢（k = 0.001–0.01 M^?1 s^?1），降低了H₂O₂裂解和•OH生成速率。调控该转换速率通常受Fe³⁺形态动力学和电子转移限制的双重约束，外部环境如pH或能量源也是关键因素。与生理条件相比，较低pH（低于3）有利于形成活性[Fe(OH)]²⁺单体，从而增强芬顿活性。然而，肿瘤内部的酸性微环境难以促进这种活性单体的形成。直接改变Fe价态是常见的内部机制调整策略，通常使用还原剂如硫化氢（H₂S）和谷胱甘肽（GSH），但刚性共价框架的强键强度降低了活性位点的暴露，限制了性能提升。

FeBPs配位聚合物的合成与表征

为实现光控酸化和配位转换，研究团队设计了光响应性铁-多酚配位聚合物（FeBPs）。通过Knoevenagel缩合反应合成了新型PAGs-Bodipy系统，将其吸收峰红移至636 nm，接近近红外（NIR）窗口以增强组织穿透性。亲水性多酚-PEG通过点击化学合成，高度有序的树枝状多酚结构通过受控酚羟基放大增强了复合物-水相互作用。FeBPs通过Fe³⁺与多酚-PEG配位形成初级Fe-多酚-PEG复合物，然后与PAGs-Bodipy进一步组装而成。X射线吸收精细结构（XAFS）分析显示Fe在FeBPs中以混合价态（Fe²⁺/Fe³⁺）存在，傅里叶变换扩展XAFS（FT-EXAFS）光谱显示出Fe─O键的主导特征峰，平均配位数为4.4 ± 0.3，表明一个Fe与四个酚羟基结合的配位模式。透射电子显微镜（TEM）显示单分散球形FeBPs，平均直径约25 nm。能量色散X射线光谱和元素映射证实了Fe、F和N在FeBPs中的均匀分布。FeBPs表现出正表面电荷（+11.6 mV），而Fe-多酚-PEG（FeP）带负电荷（-20.1 mV），证实了PAGs-Bodipy的成功整合。紫外-可见光谱在600和650 nm处显示出特征峰，归属于PAGs-Bodipy，300-350 nm的宽吸收带归因于多酚-PEG的芳香π-π*跃迁。傅里叶变换红外（FTIR）和拉曼光谱提供了Fe³⁺-多酚配位的直接证据，以及各组分在FeBPs中的整合。

光触发酸化与pH依赖性配位转换

利用罗丹明B（RhB）碱作为pH敏感荧光探针评估了PAGs-Bodipy在630 nm光照下的H⁺生成能力。光照后，RhB碱在555 nm处的吸光度显著增加，表明有效的光触发H⁺释放动力学。当封装在FeBPs中时，通过SNARF-1在560和668 nm的荧光比率响应验证了光触发酸化，缓冲溶液pH在照射10分钟后降低。这种FeBPs内的局部pH降低为Fe³⁺-多酚配位变化提供了关键微环境。XAFS分析显示，照射后Fe吸收边略有移动，意味着光触发酸化驱动的价态调整。FT-EXAFS和相应的k空间EXAFS光谱揭示了Fe配位环境的明显变化，照射后FeBPs的平均Fe─O配位数减少，表明部分Fe─O键解离。密度泛函理论（DFT）计算揭示了不同pH条件下不同的Fe³⁺-多酚配位几何结构。Fe-双复合物（FeO4复合物）在中性条件下呈现方形平面构型，而酸度增加驱动向Fe-单复合物（FeO2复合物）的显著转变。这种转变源于光诱导H⁺积累质子化儿茶酚-OH基团，这种结构变化触发单齿配体的解离。多模态光谱验证了这种配位转换。紫外-可见光谱中蓝移的LMCT带表明Fe─O配位减弱。原位FTIR分析显示，在630 nm光照下，3400 cm^?1处的─OH伸缩振动吸收峰强度显著增强并伴随蓝移，归因于光触发酸化引发的多酚羟基逐步质子化。─OH信号的增强与Fe─O配位键的断裂直接相关，因为羟基的质子化降低了多酚配体的电子给予能力，从而削弱了它们与Fe活性位点的结合。这种效应促进了Fe活性位点的加速释放，从而提高了后续芬顿反应的效率。原位拉曼光谱（500–550 cm^?1）揭示了pH依赖性峰合并。两个在525和540 cm^?1处的尖锐谱带在630 nm照射下合并成一个宽的特征峰，反映了光触发酸化驱动的铁-酚盐配位减弱，这与DFT计算的机制一致。

光驱动配位转换加速ROS生成

在630 nm照射下，FeBPs在H₂O₂存在下表现出加速的•OH生成动力学，香豆素荧光在10分钟内达到饱和。浓度依赖性关系进一步证实了ROS放大。值得注意的是，光触发H⁺释放与瞬态配位波动协同作用，使FeBPs + H₂O₂ + Light组的•OH生成动力学比FeBPs + H₂O₂组加快约10倍。电子自旋共振（ESR）光谱进一步验证了这种增强。DMPO •OH加合物强度（特征性1:2:2:1四重峰）在FeBPs + H₂O₂ + Light组中显著增加，而¹O₂信号相对较低。这些发现证实光酸诱导的配位转换促进了芬顿介导的•OH生成，而不是光照下的¹O₂产生。为展示光调控Fe²⁺可用性以持续芬顿催化，进行了全面的机理研究。循环伏安法（CV）显示还原峰出现显著的阴极偏移（约250 mV），对应于更负的电位，表明Fe³⁺还原所需的过电位增加。这种偏移归因于光诱导H⁺生成，削弱了Fe─O配位键。当用630 nm光照射不同时间后，FeBPs的还原峰电流在暴露10分钟后显著增加。该结果证实延长照射提高了H⁺浓度，进一步促进Fe─O键解离和随后的Fe²⁺释放。此外，对于不能光诱导H⁺生成的FeP，添加外源H⁺的FeP的CV曲线显示还原峰出现明显的阴极偏移，清楚表明H⁺通过削弱Fe─O配位直接促进Fe³⁺→Fe²⁺转换。值得注意的是，热控制实验确认在照射下没有可检测的热效应（ΔT < 0.5 °C），排除了潜在的光热干扰。用1,10-菲啰啉（一种Fe²⁺特异性螯合剂）的紫外-可见光谱定量进一步证实了快速光驱动Fe²⁺积累，伴随着照射下FeBPs中成比例的Fe³⁺耗竭，这验证了CV得出的结论，即H⁺诱导Fe─O配位减弱和随后的Fe²⁺释放。磁共振成像（MRI）通过纵向弛豫率（r₁）增强实时验证了Fe价态变化，该增强由低自旋d6 Fe²⁺向高自旋d5 Fe³⁺转变介导。照射后T₁加权信号衰减表明高自旋Fe³⁺向低自旋Fe²⁺转换。添加H₂O₂将r₁从2.03增加到2.28 mM^?1 s^?1，光照下放大至3.05 mM^?1 s^?1，反映了加速的芬顿效率。相比之下，缺乏光酸部分的FeP对照显示光照下弛豫率变化可忽略，证实了酸化-配位耦合特异性。值得注意的是，明显的MRI信号增强与局部Fe³⁺积累直接相关，作为芬顿效率的时空可视化。ESR光谱进一步证实了芬顿循环过程中铁自旋态的演变。与FeBPs + H₂O₂相比，FeBPs + H₂O₂ + Light系统在g = 4.26和2.02处显示出增强的Fe³⁺信号，表明照射下催化位点的逐步激活。值得注意的是，FeP在明暗条件下没有显示显著变化。为了进一步研究该机制，进行了DFT计算以比较不同配位状态的电子密度和H₂O₂活化能。电子密度差分析显示，光酸化诱导的配体解离增加了铁中心的电子密度，增强了H₂O₂在暴露活性位点的吸附。FeO2单复合物（ΔG = ?0.10 eV）显示出比FeO4双复合物（ΔG = 0.19 eV）更低的H₂O₂吸附活化障，其决速步所需能量低于FeO4。这促进了在相同时间框架内更大的•OH生成，与630 nm照射下加速的ROS产生一致。

生物相容性、细胞摄取与线粒体定位

Cell Counting Kit-8测定显示，FeBPs在三种代表性细胞系：小鼠黑色素瘤细胞（B16-F10）、人非小细胞肺癌细胞（A549）和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中，浓度高达600 μM时保持超过85%的细胞活力，表明FeBPs的细胞毒性可忽略。小鼠全身毒性评估显示，与对照组相比，肝/肾生物标志物没有显著改变，包括丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、血尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）和血液学参数。主要器官（心、肝、脾、肺和肾）的组织病理学检查通过苏木精和伊红（H&E）染色进一步证实了FeBPs处理小鼠无组织损伤，而普鲁士蓝染色显示注射后24小时这些器官中铁积累极少。这些多尺度生物相容性数据支持FeBPs的生物应用潜力。利用PAGs-Bodipy组分的内在荧光（λ_ex = 633 nm），通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）监测FeBPs的细胞内在化动力学。定量分析显示B16-F10和A549细胞中时间依赖性的细胞摄取，这一模式通过普鲁士蓝染色得到证实，显示最大细胞内铁沉积在8小时孵育时。FeBPs中PAGs-Bodipy的叔锍部分有助于细胞内在化和线粒体靶向，其赋予正表面电荷以促进细胞膜吸附和内吞作用，并进一步实现内化后选择性线粒体积累。这种线粒体定位通过与MitoTracker Green的共定位分析得到验证。高皮尔逊系数（PCC）显著超过随机分布阈值（0.1–0.3），证明了FeBPs与线粒体之间的空间重叠。

光触发细胞内酸化与ROS放大

使用pH敏感探针BCECF-AM的初步评估显示，在630 nm光照下，用FeBPs处理的B16-F10和A549细胞中荧光猝灭显著，特别是在FeBPs + H₂O₂ + Light组中，证实了光触发细胞内酸化。为建立光生H⁺与ROS放大之间的因果关系，实施了双探针成像，使用SNARF-1（一种显示pH依赖性波长偏移的比率pH探针）与DCFH-DA（一种•OH响应探针，在氧化激活时在525 nm发射波长产生绿色荧光）。在用FeBPs + H₂O₂ + Light处理的细胞中，酸化区域（由SNARF-1信号衰减指示，黄色）和ROS热点（由DCFH-DA荧光增强显示，绿色）之间存在明显的时空耦合。SNARF-1荧光的定量比率分析显示，630 nm照射下用FeBPs处理的B16-F10细胞内局部pH显著降低，同时通过流式细胞术检测到ROS升高（DCFH-DA阳性细胞：5.4%至68.3%）。这些数据机制性地证明，630 nm光触发H⁺生成导致局部细胞内酸化，从而暴露FeBPs的活性位点，进而加速芬顿反应动力学并增强细胞内ROS水平。为验证FeBPs在体内的光触发H⁺释放，使用SNARF-1比率成像（580 nm/640 nm）监测荷瘤小鼠的瘤内pH动态。630 nm照射10分钟后，荧光强度比降低，对应于通过标准曲线校准的pH从6.8快速降低至5.5。同时，DCFH-DA荧光成像显示光照肿瘤中ROS升高6.8倍。肿瘤切片的离体分析也显示FeBPs + Light处理肿瘤中有明显的DCFH-DA荧光，而4-羟基壬烯醛（4-HNE）免疫组化与二氨基联苯胺（DAB）染色显示部分棕色阳性染色，证明了脂质过氧化，表明持续的ROS生成。这些一致的体内和离体结果共同将光酸驱动的瘤内pH下降与肿瘤特异性H₂O₂过表达下的增强芬顿反应性联系起来，证实了FeBPs处理肿瘤中光触发氧化应激放大。FeBPs的顺磁性通过价态依赖性T₁加权MRI实现了ROS动态的实时监测。静脉注射FeBPs诱导进行性肿瘤T₁信号增强，在注射后20分钟达到峰值。值得注意的是，630 nm光照显著放大了这种效应，导致与未照射对照相比更高的相对信号强度。这种增强可归因于光酸驱动的ROS生成加速。此外，主要代谢器官包括肾脏和肝脏在静脉注射后显示出强烈的增强T₁加权MRI，肾脏和肝脏在注射后20分钟内快速信号增强，随后60分钟后信号衰减，表明FeBPs同时经历肾过滤和肝代谢。

光酸化调控ROS放大用于有效肿瘤治疗

通过Calcein-AM（绿色）和碘化丙啶（PI，红色）的活/死双染色揭示了光酸化依赖性细胞毒性。对照组（未处理、仅光、仅H₂O₂、仅FeBPs）保持细胞活力，主要表现为绿色荧光，而FeBPs + H₂O₂诱导部分细胞死亡，由于ROS生成导致绿色信号强度降低。引人注目的是，630 nm照射在FeBPs + Light和FeBPs + H₂O₂ + Light组中触发了剧烈的细胞毒性。Annexin V-FITC/PI染色的流式细胞术定量证实了凋亡诱导，显示FeBPs + H₂O₂ + Light组中65.7%的凋亡细胞。这意味着光触发H⁺释放促进细胞内酸化并增强ROS生成效力，从而诱导凋亡。使用JC-1膜电位探针进一步证明了光照下的线粒体失稳。630 nm照射后，JC-1聚集体（红色）减少而单体（绿色）增加。聚集体与单体荧光比率显示出与对照相比显著降低，表明ΔΨ_m崩溃——早期凋亡的标志。该现象源于三芳基锍基PAGs产生大量H⁺，破坏线粒体酸碱稳态并放大芬顿反应性，最终驱动持续•OH产生和肿瘤细胞凋亡。在B16-F10荷瘤小鼠中进一步验证了治疗效果，随机分为四个核心组（对照、光、FeBPs、FeBPs + Light），并增加FeP组（仅铁基）以排除光酸贡献。FeBPs + Light组实现了完全肿瘤抑制，21天内无再生，而单独FeBPs表现出有限的肿瘤抑制，可能是由于固有的芬顿活性差。类似地，FeP组（与FeBPs铁含量相同）在14天监测中也显示出弱的抗肿瘤效果。该观察证实仅铁基材料不能驱动有效抑制，因为它们缺乏光酸触发的H⁺生成——提升芬顿反应性的关键步骤，这进一步突出了光酸组分在FeBPs中不可或缺的作用。组织病理学分析证实了治疗特异性。H&E染色揭示了广泛的肿瘤细胞损伤，末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示与对照相比，FeBPs + Light组中凋亡细胞显著增加，证实凋亡是主要细胞死亡途径。此外，Ki-67免疫染色显示肿瘤细胞增殖活性显著降低，各组间谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达无显著差异排除了铁死亡作为主导机制。此外，全身毒性仍不可检测，表现为体重稳定。这些结果最终确定光酸驱动的瘤内酸化作为生化放大器，通过耦合H⁺介导的芬顿增强与持续ROS升高，从而实现通过氧化应激放大的有效肿瘤根除。值得注意的是，与NIR-II波长相比，630 nm光仍具有相对有限的组织穿透深度，需要进一步探索以扩展其适用性，特别是对于深部肿瘤。

结论

总之，我们通过金属-配体配位自组装Fe-多酚-PEG和光酸发生器（Bodipy衍生物）开发了一种光响应性FeBPs配位聚合物。在630 nm照射下，FeBPs表现出时空可控的H⁺释放，光酸化触发的配位转换促进了活性中心的暴露，同时在酸性条件下维持芬顿催化效率以提高•OH生成速率。金属-配体配位变化与催化微环境优化之间的协同作用实现了肿瘤特异性ROS风暴，从而崩溃线粒体膜电位并激活细胞凋亡。在小鼠黑色素瘤模型中，局部光触发H⁺生成和ROS双重攻击实现了完全肿瘤消退且全身毒性可忽略。所提出的配位工程策略克服了铁基治疗的传统限制，包括活性中心暴露不足和pH限制的催化活性，为开发适应性金属-酚类治疗诊断学建立了范式。