功能性3D结肠模型开发：疾病诱导与监测的新纪元

本刊推荐：本研究创新性地开发了一种患者来源、自由形态可逆嵌入悬浮水凝胶生物打印的三维体内模拟人结肠模型（3D-IVM-HC），其微计算机断层扫描（CT）轮廓与原CT模板偏差小于4%，可自发形成中位深度65 μm的隐窝样内陷。该模型采用双层层状明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）/藻酸盐基质，匹配天然结肠刚度（9–65 kPa），维持>95%细胞存活率且14天内代谢活性提升14倍。Caco-2上皮细胞在管腔内极化，形成连续闭锁小带-1（ZO-1）带，达到68 ± 4 Ω·cm2的跨上皮电阻（TEER），处于人离体范围。参数化有限元模拟（FEM）预测水和营养通量达人体外植体的80–99%。引入HCT116肿瘤球状体后，该模型对5-氟尿嘧啶（5-FU）的半最大抑制浓度（IC50）为540 ± 30 μM，较匹配的二维单层（42 ± 5 μM）高一个数量级，反映了临床化疗耐药性。这些基准确立了3D-IVM-HC作为一个生理真实、无动物的平台，用于探索结直肠生物学和量化药物反应。

　　

引言

传统体外和动物模型无法复现人结肠的几何结构、力学或传输物理特性，限制了其在疾病研究和药物筛选中的保真度。动物模型存在显著的物种特异性生理差异，降低了其预测准确性和临床相关性。例如，Olson等人的分析显示，约半数啮齿类毒理学发现未能准确预测人体毒性，凸显了将动物数据外推至人类临床结果的深刻挑战。此外，动物模型常未能充分捕捉人类肿瘤生物学的关键方面，如广泛的肿瘤异质性、复杂的微环境相互作用和动态疾病进展，从而显著限制了其在癌症研究中的适用性。除了科学问题，依赖动物模型还日益关联着巨大的伦理、财务和监管负担，推动了全球对更可靠、人道且经济可行的替代方案的追求。

新兴的药物发现和精准医学将依赖人类特异性体外模型进行验证，减少对动物研究的依赖。另一方面，传统的体外系统，如二维细胞培养，尽管是初始生物学和药理学研究的基础，但固有地缺乏天然组织复杂性的关键方面。这些简化系统不足以代表空间组织架构、三维细胞相互作用、机械刺激和细胞外基质（ECM）组织，显著限制了它们的生理相关性和转化潜力。为了应对这些关键缺陷，三维培养技术，包括球状体和类器官，已经出现，通过纳入细胞多样性和结构复杂性元素，显著提高了实验保真度。尽管有显著改进，现有的三维模型常常未能复现体内人体组织的全部复杂性、多样性和动态条件。先进的生物工程方法，如微生理系统（MPS）和器官芯片平台，试图通过复杂的微加工、受控流体动力学和机械刺激来克服这些限制。然而，在实现长期细胞存活、准确模拟机械线索以及忠实捕捉细胞异质性和ECM复杂性方面，仍然存在重大挑战。

根本上，组织异质性的重现对于构建真实反映天然组织复杂性、功能和疾病进展动态的实验模型至关重要。这包括准确复制不同细胞群和ECM组件之间的空间排列和相互作用。具有真实细胞异质性和准确微环境特征的模型对于阐明诸如癌症等病理学中复杂的相互作用尤为关键，其中肿瘤-基质相互作用、细胞多样性和ECM动力学在疾病进展、治疗抵抗和治疗效果中起决定性作用。

具体到结肠，最近有一些工作报告，例如整合二维肠上皮单层和微图案技术来控制分子信号并指导肠上皮的形成。另一项努力使用肠干细胞类器官耦合到MPS，生成具有管腔灌注和培养基供应的混合微芯片系统。此外，一些研究人员尝试放大柱状隐窝-绒毛模型以接种结肠上皮细胞。然而，几乎所有现有的体外结肠模型都未能充分代表（如果有的话）固有的组织异质性和中尺度架构线索，显著限制了它们对人结肠的预测准确性。

随后，精确的疾病建模和药物发现一直面临传统临床前模型固有局限性的重大挑战，这些模型无法复现人类组织特有的复杂和动态微环境。

为了解决这些关键差距，我们引入了一种创新的、最先进的三维体内模拟人结肠模型（3D-IVM-HC模型），它以无与伦比的保真度更精确地复现了人结肠的复杂微环境。选择结肠作为我们的模型是因为其在消化、蛋白质合成、营养吸收、与微生物群的共生关系以及其对结肠癌等疾病的高度易感性，结肠癌是一个主要的全球健康问题。使用计算机断层扫描（CT）衍生的解剖数据，我们精确设计了一个按比例缩小的复制品，准确纳入了关键结构特征，包括管腔曲率、多层细胞组织和隐窝样域的自发形成。这种仿生3D-IVM-HC模型精心捕捉了复杂的黏膜架构、异质性细胞组成和独特的管腔地形，超越了现有实验系统的生理准确性。除了结构保真度，该模型还通过管腔曲率驱动的上皮极化、自发隐窝形成和功能性基质-上皮相互作用来复现动态条件，捕捉了体内组织动态的基本特征。

我们的异质性3D-IVM-HC模型促进了隐窝样褶皱的自发形成，这些褶皱源于弯曲表面上的上皮增殖和聚集。虽然这些结构类似于天然隐窝形态的某些方面，但它们还不代表完全功能的隐窝，通过免疫荧光显微镜确认中位褶皱高度约为65 μm。

这种复杂的架构安排促进了稳健的细胞间相互作用，相对于传统的二维培养，细胞密度显著增加了四倍，从而增强了生理相关性和屏障功能。此外，打印后立即的细胞存活率超过90%，显著优于传统方法，突出了该模型的存活率和实际优势。

我们的3D-IVM-HC模型展示了相对于传统培养系统更高的生理相关性。具体而言，跨上皮电阻（TEER）测定证实了相对于传统的二维和2.5D共培养系统，上皮屏障完整性显著增强。此外，功能性药物反应测定显示了对5-氟尿嘧啶的化学抗性显著增加（更高的IC₅₀值），反映了更真实、临床相关的反应。我们的3D-IVM-HC模型还更好地捕捉了癌症-基质相互作用的复杂性，为研究肿瘤生物学和治疗反应提供了一个更精确的平台，具有更好的准确性和预测能力。此外，我们的3D-IVM-HC模型解决了动物研究中固有的重大实际和伦理问题。动物模型众所周知是资源密集型的，需要大量的财务投资、延长的时间线和复杂的监管合规性。通过利用我们基于人类细胞、无动物的方法，3D-IVM-HC模型显著降低了实验成本（约70–80%，用于动物采购、饲养和监管合规），并简化了时间线，从而促进了快速、成本效益高、更道德且可扩展的转化研究。重要的是，在我们的3D-IVM-HC模型中消除物种间变异性有望增强临床可转化性，为临床前研究提供一个加速且道德负责的途径。

总的来说，我们首创的仿生3D-IVM-HC结肠模型可能通过弥合临床前建模和药物评估中的关键差距，在结直肠癌研究中建立一个创新基准。通过更精确地复现天然人结肠组织的结构复杂性、细胞多样性和复杂的癌症-基质相互作用，这个创新平台可能推进机制理解，增强治疗效力评估的预测准确性，并加速高通量精准药物发现。最终，我们的综合方法对个性化医学具有变革潜力，承诺为结直肠癌患者及其他领域带来显著的转化影响和改善的临床结果。

结果

设计与制造结肠结构

结肠构成大肠的初始段，是一个长约1.5米（5英尺）、直径5厘米（2英寸）的肌肉管，对水和电解质吸收以及粪便排出至关重要。结构上，人肠的所有段，包括结肠，由四个不同的层组成：肠上皮、上皮下、肌肉层和浆膜。上皮与一个间质基质网络复杂连接，该网络由成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞、周细胞、免疫细胞和神经细胞组成。在这项研究中，为了制造我们的3D-IVM-HC，我们使用了源自人结肠CT数据的三维结肠模型，该数据由NIH提供用于研究目的。如图1A所示，CT模型被按比例缩小到大约10毫米长和5毫米直径的近似尺寸，同时保留了天然肠的关键三维结构和曲率——这些特征对于维持生理相关的细胞行为和功能至关重要。这个按比例缩小的模型具有一个内部空心管腔，便于体外重建功能性的三维肠上皮界面。同时，外层设计用于支持成纤维细胞，作为促进肠上皮分化和功能的基质细胞。

为了准确复现我们3D-IVM-HC模型中的结肠结构，我们实施了FRESH 3D生物打印技术以增强打印稳定性和精度。FRESH通过在使用低粘度水凝胶如明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）时提供结构支持，使藻酸盐作为增稠剂进一步稳定水凝胶基质。这种组合克服了与变形和不足机械稳定性相关的挑战，允许精确创建复杂且稳定的结构，紧密模拟结肠组织的力学和架构。

基于我们的3D生物打印专业知识，我们研究了四种生物墨水配方：5%和7.5% GelMA，7.5% GelMA与0.25%藻酸盐的混合物，以及7.5% GelMA与0.5%藻酸盐的混合物，旨在实现我们3D-IVM-HC模型的最佳可打印性、结构完整性、机械强度和细胞生长。所有生物墨水都表现出对3D生物打印至关重要的剪切稀化特性，通过流变测试证明（注S1和图S1，支持信息），GelMA浓度增加和藻酸盐添加增强了粘度。然而，对于卓越的结构完整性，特别是在独立模型中，粘度 alone 是不够的。值得注意的是，7.5% GelMA与0.5%藻酸盐的生物墨水在支撑浴中保持其形状方面表现出色，归因于协同交联。此外，我们表明GelMA浓度的增加和藻酸盐的掺入会增加生物墨水的粘度。由锂苯基-2,4,6-三甲基苯酰膦酸盐（LAP）（一种生物相容性光引发剂）激活的GelMA，经过UV光交联，形成共价键。藻酸盐的离子交联，由支撑浴中的钙离子触发，进一步稳定结构。这种双交联机制，利用生物相容性生物墨水，显著改善了打印后形状保持。我们优化的协议利用了组成和交联策略来实现定制应用。

为了评估生成复杂、异质性结肠组织的性能，这些组织包含多种细胞类型或生物墨水，我们开发了一种双层3D生物打印方法，专为我们3D-IVM-HC模型制造量身定制。这种方法涉及使用两种不同的生物墨水组成来复现结肠结构的不同功能层。CT扫描在Z方向切片为100层；我们首先打印外层，然后添加内层。打印过程后，我们使用UV光（405 nm）照射1分钟进行光交联结构，确保其稳定性。最后，将构建体放入培养箱中30-40分钟。这一步允许支撑浴完全溶解，释放3D生物打印的结肠结构。我们记录了这个过程的结果，提供了实际构建体的侧视图和顶视图，如图1A所示，更多协议细节可在电影S1（支持信息）中找到。此外，我们试图使用一系列图像比较指标，定量评估3D生物打印构建体与其相应的3D CT模型之间的保真度，如图1B所示。

此外，我们旨在使用一组图像比较指标，定量评估3D-IVM-HC打印构建体与其相应的3D CT模型之间的保真度。使用图像处理技术，包括转换到HSV色彩空间和颜色特定阈值处理，我们生成二进制掩码以促进构建体与背景的精确分析。此外，通过比较随机选择的50个周长点，我们确保了准确的分化和评估。这种准备使我们能够应用结构相似性指数（SSIM）和均方误差（MSE）指标来评估打印结肠与其3D模型对应物的视觉和结构保真度，如图1C所示。我们的发现，以高SSIM值（后视图和前视图分别为0.9401 ± 0.074和0.9521 ± 0.066）和低MSE值（后视图和前视图分别为0.0447 ± 0.003和0.0266 ± 0.001）为亮点，展示了3D-IVM-HC打印构建体与3D CT模型之间的强对齐和最小像素-wise 差异，强调了我们3D生物打印过程的精确性。保真度通过比较打印构建体的正交图像与CT衍生的STL模型，使用SSIM和MSE进行量化。SSIM在结构、亮度和对比度方面测量图像相似性，而MSE量化像素强度的平均平方差。虽然基于OCT的原位成像方法，如Tashman等人报告的，允许在支撑浴内进行全体积保真度评估，但我们的分析是在从支撑浴释放后进行的，在空气中成像构建体。这种释放后方法反映了实际用于生物培养的状态的几何形状，尽管可能发生由于重力或干燥引起的轻微变形。使用数码相机捕获正交2D图像，在ImageJ中处理（HSV阈值处理、二进制掩码生成和周长点提取），并与CT衍生的STL模板进行比较。虽然这种方法不提供完整的体积重建，但它产生了稳健的SSIM和MSE值，证明释放的构建体保持了与预期几何形状的高保真度。

通过将绿色和红色荧光聚合物珠子掺入墨水中，我们研究了3D-IVM-HC结构的分辨率。图1D展示了一个横截面的照片和荧光显微镜图像，以及带有荧光珠子的打印结肠的光片重建。横截面揭示了一个双层结构，层间紧密集成，光片显微镜重建进一步证实了这一点，它说明了荧光粒子在两层之间的分布以及结肠曲线架构的复现。

水凝胶的表征

为了确定我们的水凝胶配方是否模拟纤维化软组织的机械性能，我们对四种生物墨水进行了压缩测试：5%和7.5%的GelMA，以及7.5% GelMA分别与0.25%和0.5%藻酸盐混合，使用Instron系统（图2A-i,ii）。结果显示，随着藻酸盐的添加，杨氏模量（E）逐渐增加，从5% GelMA的9.8 ± 0.3 kPa，7.5% GelMA的15.8 ± 0.2 kPa，到与0.25%和0.5%藻酸盐混合物的43 ± 2.4和65 ± 8.5 kPa（图2A-ii）。模制圆盘的体积压缩，在与生物打印构建体相同的双重协议下交联，提供了标准且可再现的体积机械数据。先进技术如微或纳米压痕可能在未来的工作中补充这些结果。这些结果与报告的结肠组织力学一致，其可以跨越约1–100 kPa。尽管一些参考文献记录了健康组织的较低模量，但用于稳健3D生物打印所需的双重交联方法产生约65 kPa的最终模量。通过将我们的构建体定位在这个更宽生理范围的中段附近，我们实现了卓越的结构保真度和机械韧性——这是在循环力下保存隐窝样架构的关键因素。这反过来促进了体外真实细胞行为和组织功能性的稳定环境。基于多个标准选择了7.5% GelMA–0.5%藻酸盐的工作配方。除了可打印性、保真度和稳定性之外，还考虑了代谢活性和成纤维细胞伸长。在这种基质中培养的成纤维细胞表现出更伸长的形态，与增强的细胞-基质相互作用一致，并且该配方保持与较软候选物相当或更高的代谢活性。尽管其模量（65 ± 8.5 kPa）高于报告的结肠组织生理范围（0.6–7.3 kPa），但较软的配方（5%或7.5% GelMA无藻酸盐）无法在多層构建体中保持结构完整性，并且在打印过程中经常坍塌。因此，优先选择稍硬的配方以实现解剖保真度和可重复性。我们承认这种刚度不匹配是一个限制，并注意到未来的方向来缓解它，包括掺入软化剂、动态可降解材料或ECM模拟生物墨水。

细胞与基质之间的相互作用

我们研究了各种GelMA和藻酸盐体积比，以优化3T3成纤维细胞粘附、增殖和伸长。在这项研究中，选择3T3成纤维细胞作为基础基质细胞，以重现结肠的天然环境，为我们3D-IVM-HC模型内的细胞相互作用提供必要支持。将3T3成纤维细胞嵌入不同的水凝胶混合物中，我们通过用与F-肌动蛋白结合的鬼笔环肽染色细胞骨架来评估细胞生长。研究结果显示，较高的GelMA浓度 coupled with 较低的藻酸盐百分比有利于形成更分散和伸长的成纤维细胞网络，而不是密集的细胞聚集（注S2和图S2，支持信息）。值得注意的是，7.5% GelMA和0.5%藻酸盐的组成特别有利于结肠组织工程，在可打印性、结构完整性和细胞增殖和组织发育所需的生物力学环境之间取得了平衡。在3D生物打印中，特别是对于复杂结构，三个关键考虑因素是生物墨水的细胞相容性、交联策略以及在挤压过程中施加于细胞的剪切力。为了评估这些因素，我们通过活-死染色和作为代谢活性测定的刃天青还原，监测了3D-IVM-HC构建体内14天打印后的细胞存活率和增殖，呈现在图2B–E中。条形图（图2B）显示，构建体内的3T3成纤维细胞存活率在打印后第一天超过90%，在两周培养期结束时增加到95%以上。通过刃天青还原测定测量的代谢活性（图2C）显示，第7天增加了五倍，第14天增加了14倍。此外，光片显微镜重建和共聚焦成像提供了第1天分布在3D结构中的活细胞的清晰可视化，进一步证实了3T3成纤维细胞的高存活率（图2D）。这表明在挤压过程中遇到的剪切力、随后嵌入支撑浴以及UV光暴露没有不利影响细胞存活率，如图S3（支持信息）和注S3（支持信息）中进一步证明的。

为了评估我们的水凝胶基质在支持复杂组织环境方面的功效，我们开发了一个包含多种细胞类型的双层构建体（图2F）。与我们工程化一个功能性3D-IVM-HC模型用于肿瘤形成和治疗评估的目标一致，我们研究的这一阶段检查了基质维持异质性组织样环境的能力。具体来说，我们纳入了3T3成纤维细胞作为基质成分，并引入了HCT116结肠癌细胞来模拟肿瘤成分（注S4和图S4，支持信息）。我们选择HCT116是因为它是研究最广泛的人结直肠腺癌细胞系之一，具有充分表征的遗传谱和侵袭性生长行为——这些属性使其成为研究癌症-基质相互作用和治疗反应的稳健选择。这种结构设计使我们能够严格评估基质促进细胞相互作用和支持结肠组织模型生理架构的能力，从而为未来在受控体外模型中研究肿瘤生长动力学和药物反应奠定基础。为此，这个3D-IVM-HC构建体是按照先前定义的生物打印协议生产的，并培养了21天。3T3和HCT116细胞的初始细胞存活率在打印后第1天均超过90%。（注S5和图S5，支持信息）。值得注意的是，在水凝胶基质（内层）内，以其加剧增殖而闻名的HCT116细胞聚集成球状体，并在整个培养期间显示出显著生长。到第21天，这些球状体达到平均直径100 μm，如图2G和注S4和图S4（支持信息）中详细说明的。HCT116细胞在管腔内的快速增殖和球状体形成证实了水凝胶基质可以支持具有 distinct 基质和上皮样隔室的双层组织，从而在制造最终带有Caco-2和3T3细胞的3D-IVM-HC之前验证了设计。

此外，使用ZO-1染色在第21天评估了球状体的连接完整性。共聚焦显微镜图像显示在注S4和S6以及图S4和S6（支持信息）中，说明了球状体表面和内部组织良好的紧密连接。

细胞分布也可在图2H中观察到，该图显示了生物打印结肠的一个切片，在第14天用鬼笔环肽和DAPI染色以可视化成纤维细胞和癌细胞的细胞骨架。图像揭示了细胞在整个结构中的分布，在3D-IVM-HC模型表面浓度更高。成纤维细胞的迁移行为是明显的，它们向构建体外围移动并伸长，如通过DAPI和F-肌动蛋白免疫染色在载有3T3的生物打印结肠构建体第14天所示。特定区域的放大视图呈现在图2I（成纤维细胞）和图2J（癌细胞）中。在这些图像中，可以看到构建体表面的3T3成纤维细胞伸长并形成互连网络，有助于构建体模拟天然结肠组织架构。同时，HCT116细胞在3D-IVM-HC模型的内层内聚集成球状体。为了成像保存构建体的形态，我们将水凝胶样品嵌入1%琼脂糖凝胶中，并将其切片成1毫米切片（注S7和图S7，支持信息）。详细程序在实验部分提供。我们的3D-IVM-HC模型展示了其在支持复杂组织环境和有效复现结肠组织天然机械、结构和生理特性方面的效率，为结直肠研究提供了一个真实的肿瘤-基质微环境。

功能性3D体内模拟结肠模型的开发

开发一个准确复现天然结肠生理架构和功能性的3D-IVM-HC模型，需要精确重建上皮和上皮下层。肠道的特征是一个单层柱状上皮，主要由吸收性肠细胞组成。这些肠细胞创建一个连续的、紧密堆积细胞的保护屏障，具有最小的细胞间基质，对于胃肠道的生理完整性至关重要。为了全面模拟体外结肠模型的功能性，纳入上皮和上皮下层是必不可少的。然而，3D生物打印技术的分辨率限制对实现单细胞层制造所需的精度提出了挑战。作为初始步骤，我们利用载有3T3细胞的水凝胶制造了3D-IVM-HC模型。在我们工程化的3D支架内，一个中央空心管腔便于体外建立功能性上皮界面。在打印后第七天，将作为人结直肠上皮肠细胞模型的Caco-2细胞接种到3D-IVM-HC模型的空心管腔中。这个过程旨在形成一个上皮屏障，如图3A所示。在14天的时间里，这些细胞均匀且连续地覆盖了结构，最终形成了一个与3D-IVM-HC模型管腔相连的稳健上皮屏障。培养后第14天的免疫荧光成像证明了Caco-2细胞覆盖实现的上皮汇合，如DAPI和F-肌动蛋白染色所证明的。这说明了细胞增殖和一个密集、连续的屏障层的形成。二维和三维组织模型之间的一个主要区别是它们包含的细胞数量，这直接影响了工程化系统的功能相关性。传统二维模型通常实现每平方毫米仅几百个细胞的密度，而三维模型通过提供更生理相关的微环境容纳显著更高数量的细胞。在此背景下，我们使用荧光成像（图3B）比较了对照传统Caco-2单层与接种在3D-IVM-HC模型管腔内的Caco-2细胞之间的细胞密度。成像分析显示，3D-IVM-HC模型表现出比二维单层高四倍的细胞密度（图3C），细胞沿管腔均匀分布。这种差异是统计显著的（p < 0.001），并证明了3D-IVM-HC模型支持更高细胞数量的增强能力。3D-IVM-HC模型中增加的细胞密度可能加强工程化组织的结构完整性，并改善细胞间通信、极化和屏障功能。

此外，免疫荧光图像描绘了向管腔发展的隐窝样结构，类似于人结肠组织中发现的形态。这些结构的放大视图，如注S8和图S8（支持信息）所示，揭示了向空心管腔延伸的隐窝样结构，细胞核染成蓝色，肌动蛋白丝染成绿色。这种现象可以通过3D-IVM-HC模型的3D架构及其管腔曲率影响上皮细胞行为来成熟、极化和分化以形成隐窝样结构来解释，如先前研究显示，弯曲表面有助于顶基极化，增加肠上皮屏障功能。与Abdollahi等人使用微图案绒毛-隐窝仿生底物在微尺度增强上皮分化相比，我们的模型利用与结肠管状解剖平行的宏观管腔曲率。这种曲率不仅加强极化，还通过曲率依赖的机械和生化线索促进上皮成熟、组织自组织和空间区室化。此外，我们承认可见的打印层之间的凹槽状图案，这些图案源于有限的Z轴分辨率，本身可能作为意外的微地形线索。这些特征可能加强上皮极化和折叠行为，类似于Abdollahi等人报告的工程化仿生底物的效果。这些 emergent 微结构突出了有意设计（管腔曲率）和无意生物打印伪影在塑造上皮生长和组织中的双重影响，值得进一步研究。

成熟肠细胞典型的上皮极化表明，我们的3D-IVM-HC模型架构为肠上皮细胞附着和分化提供了一个合适的3D生态位（图3D）。为了确认这个上皮也建立了功能性屏障特性，我们评估了紧密连接蛋白ZO-1，这是完全分化肠上皮细胞的关键标志。在整个3D-IVM-HC管腔内观察到稳健的ZO-1免疫染色（图3D；图S8，支持信息），证实了上皮细胞形成对屏障完整性至关重要的紧密连接。

在肠组织工程中，使用在平面Transwell插入物上培养的极化Caco-2上皮细胞是研究上皮与病原体相互作用的成熟方法。这种方法为研究肠屏障功能和病原体入侵的潜在机制提供了一个生理准确的模型。本研究采用了一种优越的方法，通过在Transwell插入物下方整合成纤维细胞来模拟基质层，而Caco-2细胞在膜的上表面培养以构成上皮成分。这种配置更准确地复现了人肠的天然细胞微环境，使得能够增强研究上皮-基质相互作用。经过14天的成熟期后，我们采用免疫荧光显微镜研究肠上皮分化标志物ZO-1、细胞核和肌动蛋白结构的表达。

图3E说明，在这种Transwell安排中的Caco-2细胞 developed 紧密连接模式，指示单层完整性。为了进一步评估细胞形态，我们生成了Z-stacks，允许检查二维和三维生长条件之间的上皮形态。Transwell中的Caco-2细胞 consistently exhibited 上皮层的扁平单层形成。Transwell和3D-IVM-HC模型之间上皮高度的定量评估，展示在图3F中，揭示了二维Transwell格式的上皮高度约为20 μm，而三维配置中的范围从20到180 μm。这个尺度大约是天然肠内部微结构高度的十分之一，在原位测量为400–1000 μm高度。我们3D-IVM-HC模型的隐窝样结构高度分布总结在一个小提琴图中，突出显示大多数隐窝样结构的高度聚集在中位数65 μm周围。这个中位数大约是体内中位隐窝样结构高度的十分之一，跨度从20到180 μm。隐窝样结构高度的测量使用免疫荧光成像进行，测量基线在图像中 delineated（图S8，支持信息）。

当前肠芯片模型的一个常见缺点是它们缺乏沿微架构结构生理复制多样肠上皮亚型。相比之下，我们的3D-IVM-HC模型展示了一种更紧密类似于体内结肠组织架构的形态，超越了传统的二维Caco-2细胞单层培养在Transwell系统上。这些传统模型未能发展隐窝样结构，在两周培养后仅显示顶肌动蛋白丝表达。因此，我们增强的3D-IVM-HC模型 presents 一个更生理相关的体外系统，用于检查上皮完整性和功能。我们3D-IVM-HC模型的一个定义创新在于其复杂的仿生架构，具有自发形成的隐窝样域，具有准确的3D管腔曲率和复杂的黏膜架构。这种3D结构设计精心复制了天然分层细胞异质性，包括一个 distinct 外层基质层，由均匀分散的成纤维细胞嵌入机械稳健的细胞外基质中，和一个内上皮层，包含聚集成隐窝样域的Caco-2细胞。这种配置确保了局部机械和生物异质性，紧密类似于天然结肠微环境，对于真实的上皮-基质相互作用至关重要。

为了进一步检查我们3D构建体的分层架构，我们进行了苏木精和伊红（H&E）染色（图3G）。虽然H&E常规可视化天然组织中的细胞，但更 harsh 的处理步骤（例如，多次脱水和澄清阶段）通常导致水凝胶基生物工程构建