Xq24/IL13RA1畸变作为原发性纵隔大B细胞淋巴瘤女性偏倚的关键驱动因素：揭示X染色体在性别差异中的致癌机制

本综述深入探讨了原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBCL）中显著的女性发病偏倚现象，揭示了X染色体Xq24区段/IL13RA1基因异常的核心作用。研究通过综合细胞遗传学、转录组学及功能实验证实，X染色体增益（+X/Xq）、拷贝中性杂合性缺失（CNLOHX）及表观遗传再激活等女性特有机制，导致IL13RA1过表达，进而构成性激活JAK-STAT信号通路，驱动淋巴瘤发生。该发现不仅阐明了PMBCL性别差异的分子基础，也为靶向IL13RA1/JAK-STAT通路提供了新的治疗策略。

　　

Graphical Abstract

本研究通过整合多组学分析与功能验证，系统阐述了X染色体Xq24/IL13RA1异常在原发性纵隔大B细胞淋巴瘤（PMBCL）女性发病偏倚中的核心作用。

Abstract

PMBCL是一种罕见侵袭性肿瘤，呈现显著女性发病优势（男女比例1:2），提示X染色体可能参与其发病机制。为阐明X连锁因子作用，本研究对48例PMBCL（男性21例，女性27例）进行X染色体分析。分子细胞遗传学检测发现所有男性患者均存在X/Xq拷贝数增益，59.3%女性患者存在相同异常，其余女性病例则表现为细胞遗传学隐匿的拷贝中性杂合性丢失（CNLOHX，14.8%）或生殖系XX构型（25.9%）。RNAseq数据表明增益/CNLOH非随机性地涉及转录活跃X同源染色体。转录组分析将IL13RA1（Xq24）确定为Xq畸变的关键靶点。免疫组化证实84.2%病例表达IL13RA1蛋白。值得注意的是，具有生殖系XX的女性PMBCL中IL13RA1蛋白表达提示表观遗传再激活和Xi上IL13RA1的表达。体外功能研究表明IL13RA1过表达能够转化小鼠原B细胞并构成性激活致癌性JAK-STAT信号通路。新型致病性Xq24/IL13RA1缺陷作为PMBCL的疾病定义性畸变，驱动肿瘤发生并导致性别差异。女性PMBCL优势源于女性特有遗传/表观遗传机制（CNLOHX和Xi上IL13RA1再激活）导致获得致病性Xq24/IL13RA1缺陷的更高风险。

INTRODUCTION

PMBCL主要影响年轻女性，分子发病机制涉及NFkB、JAK-STAT信号通路、PD-1介导的免疫逃逸和表观遗传不稳定通路。常见遗传异常包括9p24.3（JAK2-CD274-PDCD1LG2）、6p22.2（HIST1H1C）、2p16.1（REL）和9q34.3（TRAF2）增益，6p/MHC拷贝中性杂合性丢失以及SOCS1、B2M、ITPKB、STAT6、NFKBIE和GNA13突变。PMBCL中性别差异的机制未明，X染色体可能发挥重要作用。X染色体基线遗传学较常染色体更复杂，女性通过X染色体失活（XCI）平衡基因剂量，XISTRNA介导表观遗传沉默，但超过20%X连锁基因逃逸XCI（逃逸者），女性淋巴细胞倾向于增加Xi表达。癌症性别差异，特别是男性更高癌症风险，引起科学家日益关注，X连锁基因尤其是逃逸者在肿瘤发生性别偏倚中起重要作用。先前研究发现男性偏倚肿瘤中六个“X失活逃逸肿瘤抑制因子”（EXITS）（ATRX、CNKSR2、DDX3X、KDM5C、KDM6A和MAGEC3）存在男性偏倚突变。PMBCL分子遗传学研究常规忽略X染色体，性别差异问题仅有一个团队探讨。本研究对PMBCL中X连锁畸变进行全面分析，鉴定出靶向IL13RA1/Xq24的普遍原发性X染色体遗传缺陷，这些缺陷导致PMBCL女性偏倚。

MATERIAL AND METHODS

Study material

从临床数据库回顾性选择经组织病理学诊断为PMBCL的患者，根据诊断活检材料、DNA和/或存档细胞遗传学沉淀及临床随访数据的可用性进行筛选。预处理标本从本机构肿瘤库获取。8例可获得外周血 constitutional DNA。研究队列包括48例病例，含21例男性和27例女性。病例由两位血液病理学家根据最新WHO血液淋巴肿瘤分类和2022年成熟淋巴肿瘤国际共识分类进行复核确诊。除一例外所有病例均具有纵隔大块病变、成熟B细胞免疫表型及至少部分CD23和/或CD30表达。CD23或CD30表达有限的病例，该实体特有的分隔纤维化存在被视为必需。病例显示9p24（86%）和2p16（37.2%）频繁增益。一例25岁无纵隔受累女性患者亦被纳入，其位于小肠的肿瘤显示典型形态特征，包括间质纤维化和CD30、CD23、MAL免疫组化强弥漫表达，以及9p24CN增益，与典型PMBCL相似。相关临床特征总结于表1。男女患者中位年龄、临床表现、结局和当前状态相似，但多数男性患者处于II期（77.7%），而女性患者同等分布于II期和IV期（各38.5%）。另选择8例结节硬化经典霍奇金淋巴瘤（NSCHL）用于免疫组化。两个PMBCL来源细胞系Karpas 1106P和U2940分别从ECACC和ATCC购买。两个NSCHL来源细胞系L428和L1236从DSMZ购买。伦理委员会批准本回顾性研究并免除书面知情同意需求。

Methods

应用方法包括常规和分子细胞遗传学、RNA荧光原位杂交（FISH）、免疫组化（IHC）、新一代测序和体外功能研究，详见支持信息S12。

RESULTS

Male PMBCL patients show gains of X/Xq

项目起始于在三位男性PMBCL（M-PMBCL）患者中鉴定出与超数der(X)相关的新型t(X;14)(p11.4;q32.33)(表2，图1A)。病例1的FISH分析（支持信息S1:表1）证实der(X)重复、IGH（14q32.33）重排，并排除已知在边缘区淋巴瘤中靶向GPR34（Xp11.4）的t(X;14)(p11.4;q32.33)参与（图1B-D）。随后病例3中Xp特异性DNA探针FISH分析及阵列比较基因组杂交（aCGH）分析将Xp11.4断点定位至BCOR远端约132kb（chrX:39530321–39893990bp[hg19]）（图1E,F，支持信息S1:表1）。由于其位于基因稀疏区域[der(14)上首个编码基因MID1IPA约1.25Mb away]，IGH驱动的t(X;14)的分子后果仍不明确。

三位M-PMBCL病例中der(X)的引人注目的重复促使我们检查18例明确记录的M-PMBCL病例（表2）中X染色体遗传谱。这些病例随后通过着丝粒探针（CEPs）针对X、Y和6（倍性水平对照）进行三色间期FISH（iFISH）分析。分析在所有样本中鉴定出具有额外CEPX信号（X,+X）的细胞克隆（表2，图2A,B右面板示例）。随后单核苷酸多态性（SNP）阵列分析（病例4-12）（图2A,B左面板示例）和病例13中循环细胞游离DNA（ccfDNA）的超低深度测序（UPS）证实iFISH数据。值得注意的是，病例4和13分别显示X部分重复，限于Xq和选择性扩增的Xq22.1q27.3区域。

Chromosome X aberrations are common in female PMBCL patients

为确定女性患者中X相关CN异常频率，下一步我们对27例诊断性女性PMBCL（F-PMBCL）病例和两个女性来源PMBCL细胞系（Karpas 1106P和U2940）进行iFISH（支持信息S1:表1）、SNP阵列和/或ccfDNA的UPS分析。结果总结于表3。4例可获得细胞遗传学数据。除先前讨论的克隆基因组不平衡外，病例显示 either 生殖系XX构型（加零星局部缺失）（病例22-28）或细胞遗传学隐匿的CNLOHX（别名单亲二体）（病例29-32）或X全/部分CN增益（病例33-48）。鉴定出的X染色体异常示例如图2C-F。有趣的是，病例48的细胞遗传学和FISH分析鉴定出具有单纯X增益（47,XX,+X）的肿瘤干系，伴随共存主要旁系中继发性细胞遗传学异常（支持信息S7:图1）。Karpas 1106P和U2940的SNP阵列分析证实已知X染色体异常并在U2940中鉴定出两个新型CNLOHX损伤（图2H）。

图3A总结了共37例分析的M-和F-PMBCL病例中鉴定出的X染色体不平衡。数据汇编允许定义增益/CNLOH的最小共同区域。这个约43Mb区域位于Xq21.1q27.3（chrX:99500001–14250000bp[hg19]），代表病例13中扩增的Xq片段（图3B）。值得注意的是，它覆盖了病例33中选择性增益的较小Xq22.1q26.3（chrX:100890285–137943387bp[hg19]）区域。

Common gain of an active X chromosome in PMBCL

为确定PMBCL中X染色体不平衡是随机（影响Xa和Xi）还是非随机（仅影响Xa或Xi），我们试图确定可用PMBCL病例中所涉及X染色体的激活状态。28个肿瘤样本（10例M-PMBCL和18例F-PMBCL）和8个对照（非恶性）淋巴结样本（4例男性和4例女性来源）进行批量RNA测序。为分析，样本根据性别和X连锁染色体异常分为四组：（1）M-PMBCL,+X/Xq（病例1,4-12），（2）F-PMBCL,+X/Xq（病例33,35-39,41-44），（3）F-PMBCL,CNLOHX（病例30-32），和（4）F-PMBCL,XX（病例22-25,28）。X连锁基因表达平均值与常染色体基因表达平均值之比（X与常染色体表达比）用于确定与对照相比X连锁基因表达是否增加。我们发现与男女对照相比，代表M-PMBCL,+X/Xq和F-PMBCL,+X/Xq的病例中X与常染色体表达比显著增加（图4A）。F-PMBCL,CNLOHX样本中该比值有增加趋势，但由于样本量小（三样本）不显著。在合并的F-PMBCL,CNLOHX和F-PMBCL,+X/Xq组中，增加比值显著（P=0.0001029）。F-PMBCL,XX样本中X与常染色体表达比保持不变。这些发现表明在M-和F-PMBCL中增益或受CNLOH影响的X染色体是活跃的（Xa）。换言之，PMBCL中X/CNLOHX增益是非随机的并选择性影响Xa。

为验证数据，在Karpas 1106P和U2940细胞系上进行hXIST（Xq13.2）和X连锁基因HDAC8（Xq13.1）和HUWE1（Xp11.22）RNA探针的RNA-FISH分析（图4B和支持信息S8:图2A）。以女性人成纤维细胞系为对照。在60个信息细胞中每细胞计数各探针信号数，同时对探针和细胞系设盲（支持信息S8:图2B）。在女性成纤维细胞（XaXi）中，观察到单个hXIST（Xi）、hHDAC8（Xa）和hHUWE1（Xa）信号。所有Karpas 1106P细胞显示一个hXist信号，部分细胞显示两个hHDAC8和两个hHUWE1信号，提示Xa增益。U2940部分细胞中hXIST信号缺失及两个hHDAC8信号和一个hHUWE1信号存在与CNLOH相关Xi丢失和Xa部分重复一致（表3和图2H）。

Gain of an active X chromosome in PMBCL is associated with IL13RA1 expression

鉴于X连锁基因表达在多数PMBCL样本中增加，我们试图研究 within 增益/CNLOH最小区域（Xq22.1q27.3/99.5-142.5Mb）哪些X连锁基因在PMBCL病例中失调。在这个约43Mb区域中817个蛋白编码基因中，只有少数在PMBCL亚组中普遍失调（图5A-F）（支持信息S9:图3A）。24个基因在四个+X/CNLOH的PMBCL亚组中普遍上调（支持信息S9:图3B，支持信息S2:表2）。这些基因包括IL13RA1和NKRF，两者先前均与免疫功能和癌症相关。基于先前PMBCL中独特IL13RA1表达的观察以及NKRF的肿瘤抑制特征，我们将IL13RA1视为最佳候选基因。在我们的研究设置中，F-PMBCL,XX亚组中未发现显著表达的X基因（图5E）。两个细胞系显示Xq基因表达增强，但其中大多数包括IL13RA1并未显著上调（图5F）。

Common expression of IL13RA1 in PMBCL

通过免疫组化（IHC）检测PMBCL中IL13RA1蛋白表达水平。IL13RA1血清（PA528309,ThermoFisher）应用于4个非恶性淋巴结活检、38个可用PMBCL病例、两个细胞系及另外8例NSCHL（支持信息S5:表5）。在“反应性”淋巴结中，抗体染色生发中心中心母细胞和滤泡树突细胞，与鼠淋巴结相似。多数PMBCL肿瘤（13/15M-PMBCL和19/23F-PMBCL病例）显示阳性免疫染色（表2和3），而两个细胞系为IL13RA1阴性。所有NSCHL病例显示IL13RA1蛋白膜表达。IHC染色代表性示例如图5G-J。通过IL-13Rα1的RNA原位杂交验证IHC发现是可取的。

Frequent mutations in components of the IL4-IL13 signaling pathway

为研究PMBCL中蛋白编码改变，对19例PMBCL病例进行全外显子组测序（WES）分析，包括8例肿瘤/正常组织配对病例（5,8,10,11,22,25,42,43）。两个细胞系进行全基因组测序（WGS）。队列包含9例M-PMBCL样本（+X/Xq）和10例F-PMBCL样本（5例XX，3例CNLOHX/Xq，2例+X）。8例病例（肿瘤/正常对）和细胞系的突变数据已发表。此处我们聚焦于IL4/IL13信号通路组分的突变状态（图6A）。结果与相关SNP阵列和IL13RA1IHC数据整合显示于图6B。SOCS1、STAT6、IL4和IL13RA1突变分别检测于67%、52%、43%和19%样本。五例F-PMBCL中四例具有生殖系XX显示STAT6（28号）、或SOCS1（22号）、或IL13RA1和SOCS1（26号）、或SOCS1和STAT6（27号）突变。Karpas 1106P和U2940中已知IL4R/IL13RA1突变被证实。我们和Noerenberg等检测到的IL13RA1突变定位显示于图6C。所有这些突变位于预测具有高致病性评分的氨基酸改变区域。使用癌症细胞分数（CCF）分析估计获得性突变的克隆性和层次结构，应用于至少三个样本中突变的56个基因。使用95%CCF截断值调用突变克隆。支持信息S10:图4A中呈现的基因根据克隆性降低程度排序。鉴于最克隆突变被视为早期基因组事件，最亚克隆突变被视为晚期基因组事件，IL4/IL13通路组分中获得突变的层次结构如下：STAT6（87.5%）、IL4A（73%）、SOCS1（59%）和IL13RA1（34%。分析基因中个体突变的CCF显示于支持信息S11:图4B。

IL13RA1 expression confers cytokine-independent growth

为功能检查IL13RA1过表达的致癌能力，我们使用鼠IL3依赖性原B细胞系Ba/F3，一个为评估激酶癌基因转化效力而开发的流行模型系统。内源性Il13ra1和Il13ra2低/不可检测表达水平及Il4ra高表达，提示IL13信号在Ba/F3细胞中不活跃，使该模型特别适合我们研究。我们将人IL13RA1ORF克隆到带有IRES-GFP报告基因的pMIG载体中。用该载体（而非空载体）逆转录病毒转导Ba/F3细胞导致IL13RA1过表达并赋予IL3非依赖性生长（图6E）。值得注意的是，当细胞用IL13刺激时，IL13RA1转化更快。随后IL13耗竭对转化细胞活力无影响（图6F,G）。如图6H所示，IL13刺激导致IL13信号通路更强激活，由Stat6下游磷酸化说明。显著地，转化后我们观察到对低/不可检测Socs1表达细胞的强选择，这与PMBCL中频繁突变驱动SOCS1失活一致。IL13RA1过表达转化的Ba/F3细胞对JAK-STAT抑制敏感（图6I,J）。为在人类模型中验证我们发现，我们使用L428和L1236霍奇金淋巴瘤细胞系，因为这些细胞系显示高IL13RA1表达水平。根据公共CRISPR依赖性数据，L1236细胞系强烈依赖于IL13RA1，而L428则不太明显（图6K）。与此观察一致，我们能够显示L1236细胞对JAK-STAT抑制敏感，而L428细胞不敏感（图6L,M）。

DISCUSSION

PMBCL是少数影响女性的非生殖系统肿瘤之一（F:M/2:1）。为深入了解驱动PMBCL性别偏倚发病机制及导致此现象的潜在X连锁因子，我们分析了一系列诊断性男性（21）和女性（27）PMBCL病例中X染色体遗传谱。分子细胞遗传学分析不仅证实此肿瘤中XCN增益的早期观察，而且首次证明此非整倍体频率在性别间显著变化，存在于100%男性和约60%（16/27）女性PMBCL中。其余女性患者显示 either 细胞遗传学隐匿CNLOHX（14.8%）或生殖系XX构型（25.9%）（图7）。特别重要的是基于RNAseq的发现，即CN增益和CNLOH中非随机涉及活化X同源染色体，导致PMBCL中X基因剂量补偿显著破坏。进一步分析将IL13RA1（Xq24）鉴定为PMBCL中潜在靶向的X连锁因子。此选择受其位于CN增益/CNLOH最小共同区域的遗传定位、在绝大多数分析病例中mRNA和蛋白水平显著上调以及与免疫功能和癌症的功能联系支持。具有生殖系XaXi构型的 enigmatic F-PMBCL病例中IL13RA1蛋白表达的分子基础仍不明确。我们假设IL13RA1在这些肿瘤样本中可能逃逸XCI（图7B），导致足够表达以产生IHC可检测的IL13RA1蛋白并驱动疾病，但不足以引起研究中设置的表达显著增加。我们的假设得到逃逸者先前研究支持，显示它们从Xi的表达显著低于Xa。此外，缺乏类似表达IL13RA1的M-PMBCL,XY病例排除了此过程中未知Xi无关机制的贡献。尽管IL13RA1不是组成型逃逸者，先前报告已显示该基因在非恶性和恶性细胞中可变异逃逸XCI。我们的RNAseq基于发现在两个经受hXIST RNA-FISH的PMBCL来源细胞系上验证（图4B）。值得注意的是，Karpas 1106P和U2940显示低mRNA和蛋白表达水平。类比IL7RA驱动的T-ALL，我们假设已建立的PMBCL来源细胞系可能不再需要高水平IL13RA1，特别是在存在IL4R驱动突变时。此处报告的发现在更大系列病例上验证是必要的。然而，鉴于国际小组在PMBCL中生成的大量跳过X连锁数据，此任务无需特殊实验努力即可实现。

值得强调的是，PMBCL中IL13RA1的独特表达已在先前基于基因表达的研究中报告。值得注意的是，Rosenwald等将IL13RA1识别为继PDL2和SNFT之后最佳区分PMBCL与DLBCL的第三个基因（与DLBCL相比1.9倍变化）和PMBCL预测因子中的顶级基因。据我们所知，然而，PMBCL中IL13RA1异常表达的分子机制从未被探索。IL13RA1编码IL-13Rα1蛋白，与IL4Rα一起构成T细胞衍生IL4和IL13共享的IL4受体II型。细胞因子通过JAK-STAT级联通路信号传导，导致JAK2激活、STAT6磷酸化及随后促进控制淋巴细胞增殖和激活的STAT6靶基因转录，并直接影响肿瘤增殖。尽管JAK-STAT信号通路构成性激活在PMBCL中有充分记录，负责此现象的刺激因素尚未阐明。

在Ba/F3（鼠IL3依赖性原B细胞系）上进行的IL13RA1功能研究表明，过表达IL13RA1可通过激活下游JAK-STAT级联转化这些细胞并诱导其IL3非依赖性生长。IL13刺激下IL13RA1转化潜力更强，但一旦转化，细胞生长不需要IL13补充。重要的是，转化的Ba/F3细胞对JAK-STAT抑制敏感。选择鼠而非人模型是此项工作的严重限制，但证明IL13RA1在已转化/工程化人细胞上的转化潜力具有挑战性。尽管有这些限制，我们的研究为PMBCL中致癌性JAK-STAT信号通路构成性激活的分子机制提供了新见解。迄今为止，此过程仅与涉及基因中的体细胞突变和9p24（JAK2/JMJD2C）扩增相关。我们的研究表明JAK-STAT级联主要通过基因剂量敏感IL13RA1的增强表达而被激活， due to 其转录活跃等位基因增益或可能由于Xi上沉默等位基因的表观遗传再激活。病例48干系中单纯+X的细胞遗传学发现证明了此原发性遗传异常在PMBCL发病机制中的关键作用。显然，继发性JAK/STAT相关突变，包括IL13RA1中的突变（图6B,C），增加通过此通路的信号强度，并推测有利于驱动淋巴瘤细胞生长和疾病进展。

值得注意的是，NSCHL也以IL13RA1增强表达为特征（图5J）。然而，与PMBCL相反，此肿瘤中IL13RA1和下游JAK-STAT信号通路的激活由肿瘤性霍奇金细胞自泌IL13生产驱动。PMBCL和NSCHL在临床表现上显示众多独特相似性，包括纵隔受累和诊断时年轻患者年龄、细胞遗传学标志（9p24和2p16扩增）和基因表达谱。另一方面，两种淋巴瘤不同的形态学和免疫表型特征表明它们不同的细胞起源。根据最新WHO分类，NSCHL显示轻微女性优势。NSCHL中缺乏 hallmarking Xq24不平衡（未发表数据），驱动IL13RA1异常表达和PMBCL女性偏倚，额外支持PMBCL与NSCHL的区别。

导致PMBCL性别差异的遗传机制总结于图7。此肿瘤中偏倚的F:M/2:1发病率比值似乎源于女性获得Xq24/IL13RA1异常的更高风险。虽然两性具有通过不分离获得Xa增益的相似风险，女性可能暴露于影响Xa和/或Xi的额外遗传机制（CNLOH、逃逸XCI），这些机制在男性中不操作（图7C）。我们推测其余非生殖系统女性癌症由类似X相关机制驱动。当前可用数据已记录至少三种女性癌症中Xa/Xi频繁遗传和表观遗传异常，包括充分研究的乳腺癌（BC）和两种罕见肾细胞癌（RCC）亚型（嫌色细胞RCC和Xp11易位RCC[tRCC]）。在我们研究背景下，值得注意的是男性BC中X染色体常见增益和罕见Klinefelter综合征诊断的男性BC中超数Xi丢失随后Xa multiplication。X染色体（富含免疫相关基因）在女性偏倚自身免疫 disorders 中的重要作用已被广泛讨论。

总结而言，我们的研究为X染色体在PMBCL发病机制中的作用提供了全新视角。我们显示所有PMBCL病例，不论性别，均以遗传或可能表观遗传Xq24缺陷为特征，导致IL13RA1基因剂量/表达增加和致癌性JAK-STAT信号通路构成性激活。这些致病性打击作为原发性疾病定义性异常出现，而IL13RA1增强表达是淋巴瘤发生 initiation 的必需条件。然而，此过程中其他X连锁蛋白编码和非编码因子的复杂性不被排除。重要的是，Xq24异常在PMBCL性别差异中起关键作用。我们的发现支持女性偏倚癌症由过表达X连锁癌基因驱动，而男性偏倚癌症由X连锁肿瘤抑制基因失活突变启动的假设。此处报告的发现外推至其他女性癌症，包括BC，可能为鉴定新型X连锁致癌因子铺平道路。最后，我们的研究指出IL13RA1作为PMBCL患者治疗中新的潜在药理学靶点。鉴于IL4/13信号通路在炎症性疾病和癌症中的已知作用，两种细胞因子及其受体引起科学界日益增长的兴趣。针对IL13/IL13RA1轴的分子治疗方法和细胞疗法的进一步发展是必要的。