外显子测序与染色体微阵列在拷贝数变异临床检测中的高度一致性及诊断效用评估

《Clinical Genetics》：High Concordance of Copy Number Variants Detected by Chromosomal Microarray and Exome Sequencing in Clinical Diagnostics

本研究系统评估了外显子测序（ES）作为一线临床诊断工具在拷贝数变异（CNV）、三倍体及单亲二倍体（UPD）检测中的性能，证明ES与染色体微阵列（CMA）具有98.9%的一致性，且能识别CMA无法检测的小规模CNV（如单外显子缺失），为神经发育障碍和先天性畸形的综合诊断提供了高效、经济的解决方案。

引言

外显子测序（ES）最初用于检测单核苷酸变异（SNV），但十余年前研究证实可通过读深分析推断拷贝数变异（CNV）。早期CNV检测工具如XHMM、CoNVEX、CoNIFER、ExomeDepth和HMZDelFinder的开发推动了这一应用。随着算法不断优化，ES在CNV检测中的敏感性和特异性显著提升，多项研究通过对比染色体微阵列（CMA）、全基因组测序（WGS）或模拟CNV插入BAM文件进行评估。ES整合CNV分析可提高诊断率2%-19%，具体取决于先前的检测、转诊指征和队列规模。近年来，ES被倡导作为神经发育障碍的一线检测工具，尤其在产前诊断中，可同时检测SNV和CNV，实现快速（<14天）和高诊断率（CNV占8.8%，SNV占绒毛样本41.7%和羊水样本18.1%）。ES-first策略还能节省成本（约1500-3200美元/人），并在资源有限环境中得到认可。然而，临床实践中CMA仍常优先于ES使用。本研究旨在评估ES作为一线诊断工具的适用性，比较ES与CMA的CNV检测敏感性，回顾性分析ES检出的CNV，并探讨ES在UPD和三倍体检测中的性能。

材料与方法

所有家庭均签署了ES和CMA检测的知情同意书。ES检测采用xGen Exome Research Panel IDT-V2和xGen Human mtDNA Research Panel v1.0进行外显子序列富集，在NovaSeq6000系统上生成161-bp双端测序数据。FASTQ文件上传至Geneyx Analysis平台，使用Illumina DRAGEN进行比对和变异调用，参考基因组为hg19（GRCh37）。CNV分类由细胞遗传学专家根据ACMG和ClinGen指南手动完成，利用PubMed、DECIPHER、UCSC、ClinGen、ClinVar、HGMD、DGV等数据库及内部20000例CNV数据集，并通过Franklin进行验证。CMA使用Affymetrix CytoScan 750K阵列，分析参数为：最小25个标记、最小大小100 kbp、置信阈值85%，LOH分析最小大小为5 Mb。UPD分析基于三人家系数据，通过比较子代与亲代的基因型，使用二项统计检验和Bonferroni校正识别UPD。等位基因频率分布基于SNV等位基因比率与0.5的绝对差异，按染色体汇总，类似B-等位基因频率计算。三倍体筛查使用Python脚本，过滤独特杂合变异（DP≥20），排除重复区域变异，计算Alt_Fraction和AbsValue（|0.5-Alt_Fraction|），三倍体个体AbsValue常超过0.6。

结果

CNV检测率比较：ES与CMA

研究队列包括6447例无关先证者，其中214例同时进行了ES和CMA检测。为评估技术而非诊断率，分析包括VUS。从CMA数据中提取罕见CNV（<1%），阈值>100 kbp，探针覆盖>25，判断ES是否独立检出。产前检测发现247个CNV（181例），产后检测发现46个CNV（33例）。64%为重复，36%为缺失，90%为VUS，10%为P/LP。ES初始检出271/293（92.49%）CMA发现的CNV。进一步分析显示，22个未检出CNV中19个位于非捕获区域（如上游元件、内含子、UTR），无一为P/LP。排除技术不可检测病例后，ES检出271/274（98.9%）CNV。其余3例因技术限制未检出：Xp22.33的1.38 Mbp缺失（含SHOX）、16p13.11的150 kbp重复（VUS）和17q21.31的131 kbp重复（含KANSL1第一外显子，VUS）。仅1/274（0.36%）为P/LP。

临床相关CNV：全尺寸范围

回顾性分析6447例先证者中ES报告的CNV。1563例产前案例（多数有超声异常）和4884例产后案例中，分别59例（3.8%）和217例（4.4%）报告CNV。多数案例先进行CMA检测，致病性CNV通常不进行ES，导致ES队列CNV率较低。部分个体携带多个CNV，共报告288个缺失或重复事件（276人）。产前21.3%（13/61）和产后22.0%（50/227）为VUS。46.9%为杂合缺失，28.8%为重复，17.4%为纯合缺失。CNV大小分布：35.1%<100 kbp（CMA难检测）。纯合缺失几乎全在最小区间（0-100 kbp），可能因大纯合缺失致死或大杂合缺失生育力降低。几乎所有纯合缺失为基因内，涉及单基因单或多外显子，且均位于纯合区域（ROH）。50例纯合缺失中48例为P/LP，2例为VUS。复发性纯合缺失包括NPHP1（致肾痨）、CLCNKB（致Bartter综合征）和SMN1 exon 7缺失（致脊髓性肌萎缩）。重复在小尺寸范围内较少，可能因1-2外显子重复检测困难。ES可检出全尺寸CNV，示例如下。

非整倍体、微缺失和微重复

ES检测大CNV或全染色体事件具挑战性，但仍检出完整和嵌合三体（包括13、16、18、21三体）和性染色体非整倍体（45,X和47,XXY）。同时检出微缺失和微重复，如7q11缺失、16p11缺失、16p11.2重复、22q11缺失和22q11重复。

基因内CNV

单外显子CNV检测困难，尤其杂合时可能假阳性，因此仅在表型重叠或新发时报告。仅7例经MLPA确认（表S3和S4中标*）。示例1：儿童运动延迟（24个月行走）、语言延迟、热性惊厥、MRI轻度脑室扩张。21个月时体重10 kg（7%）、身长82.5 cm（37%）、头围47 cm（47%），体格检查显示舟状头、高前额、长脸、张口流涎、小下巴、张力过低和单个咖啡牛奶斑。CK正常。CMA未检出相关CNV，ES未发现SNV。ES-CNV分析提示NSD1 exon 5杂合缺失（最小边界chr5:176636636-176639196 [hg19]）。NSD1致病变异致Sotos综合征（过度生长、学习困难、特殊面容），但该儿童生长参数正常，临床诊断困难。ES检测的exon 5缺失经MLPA在儿童中确认，父母无，确诊并遗传咨询。示例2：10岁女性全局发育延迟、房间隔缺损、外斜视、双侧视盘苍白、眼球震颤和步态不稳。检查发现下唇外翻、双侧耳前凹和第五指中节指骨发育不全。ES发现ARID1A exon 9新发杂合缺失（最小边界chr1:27092711-27092857 [hg19]），MLPA确认，致Coffin-Siris综合征2型。示例3：HNF1B杂合单外显子缺失（致肾囊肿和糖尿病综合征），MLPA确认。

CNV与SNV反式排列

ES-CNV分析可识别与SNV反式的CNV。示例：两同胞舞蹈症、认知下降和癫痫。年长同胞30年代初发，ES发现VPS13A杂合SNV（chr9:79946991 [hg19]；NM_015186.4: c.6058delC; p.(Pro2020fs*9)）。VPS13A双等位基因致舞蹈-棘红细胞增多症，但未发现第二变异。ES-CNV分析发现VPS13A单外显子缺失（最小边界chr9:80018151-80018237 [hg19]），与SNV共同确诊。

CNV与SNV双重诊断

CMA作为一线检测发现CNV时，临床医生可能视为确诊而不进一步检测，遗漏临床显著SNV。ES单一分析同时检测CNV和SNV。示例1：近亲夫妇婴儿畸形、动脉干和干燥症。ES发现21三体和MPDU1纯合变异（致糖基化障碍1f型）。ES快速检测双变异，婴儿混合表型掩盖21三体典型面容。细胞遗传学发现经CMA确认（个体死亡，无样本核型分析）。父母咨询常隐遗传和未来妊娠计划，需父母正常核型排除平衡易位。示例2：临床诊断Down综合征婴儿反复呕吐、生长失败和肠外营养依赖。严重表现促ES，发现PTPN11杂合已知致病变异（chr12:112910785G>A [hg19]；NM_002834.5:c.794G>A; p.(Arg265Gln)）。婴儿兼有Down和Noonan综合征。生物学父母无法SNV分离。示例3：婴儿主动脉缩窄、畸形和肛门闭锁中发现7q11.23缺失（致Williams综合征）。非典型表型促ES，发现LEMD3杂合移码变异（致Buschke–Ollendorff综合征）和7q11.23缺失。这些示例显示同时研究CNV和SNV的重要性，CMA单独会提供不完全诊断。

ES数据的额外诊断效用：媲美CMA

SNP阵列增强CMA诊断效用，可检测拷贝中性变异（如ROH和UPD）和三倍体（69条染色体），传统CMA无法识别。ROH分析常规进行于每个外显子，支持纯合CNV调用。

单亲二倍体（UPD）

为研究UPD（等臂和异臂），对队列中1494例三人家系进行自动化UPD分析，基于常见SNV的亲本遗传和统计分析。检出17例UPD（率~1.14%），包括4/17（23.5%）等臂和13/17（76.5%）混合异/等臂。UPD涉及11条不同染色体，无异臂全染色体。仅1例UPD为父系，16例母系。等臂事件得到DRAGEN的ROH调用支持（大ROH事件贯穿等臂区域）。多数事件在产前组（14/17, 82.4%），对应CMA发现大ROH的胎儿。5例预期致印记障碍。

三倍体检测

三倍体检测挑战性，CGH-only CMA测量相对拷贝数，log2比率图在二倍体和三倍体相似。传统ES读深CNV分析可能失败，尤其女性。为此开发算法自动化三倍体筛查，绘制B-等位基因频率（BAF），搜索0.33和0.67双峰分布（代表1:2和2:1等位基因频率，类似SNP阵列）。在6447例队列中发现1例三倍体，扩展分析所有191例流产胎儿ES样本，发现5例阳性（检出率2.6%），包括2例男性（69,XXY）和3例女性（69,XXX）。三倍体经CMA分析确认。

讨论

本研究系统评估ES作为高近亲队列一线诊断测试的性能，聚焦CNV、三倍体和UPD分析。CNV方面，ES可靠检出绝大多数临床相关事件，与ES作为CMA经济高效替代的先前研究一致。但ES有技术限制：某些基因组区域覆盖不均降低敏感性；非编码区域致病CNV（影响启动子、增强子或剪接调控元件）可能漏检；假基因对齐错误可致假阴性；很短CNV可能假阳性。这些限制凸显ES阴性病例反射WGS的重要性。新兴混合方法（如低深度WGS结合高深度ES或ES补充微阵列等效骨架）是增强CNV检测的有前景替代策略。

队列中临床报告CNV频率较低（产前3.8%，产后4.4%），可能因CMA仍为神经发育延迟/多发畸形的一线测试，多数CMA分辨率CNV由CMA检出。与先前结果一致，多数CNV（无论致病性）为重复，但缺失更常报告（因更可能破坏基因功能）。队列中高比例纯合缺失反映转诊人群高近亲率和共享祖先。特定工具开发用于识别纯合缺失，优化部分或单外显子缺失。支持证据（如CNV边界内SNV和周围ROH）可增加纯合CNV调用置信度，对近亲人群尤有用。

多项研究证明ES整合CNV分析提高诊断率，ES能检测宽尺寸范围CNV，包括CMA分辨率以下小基因内事件。但ES-CNV检测需分析专业知识和足够本地测序数据区分真阳性与技术假象。建议单/双外显子CNV仅在严格质量控制、良好基准CNV检测工具和表型一致时报告，并经正交方法（如MLPA或ddPCR）确认，因ES-CNV可靠性在缺失<100 kbp和重复<500 kbp时降低。由于缺乏所有个体CMA数据，无法计算CNV精确增量诊断率，但突出基因内CNV示例（CMA阈值以下），强调ES在识别CMA遗漏临床显著缺失的附加价值。

SNP阵列提供额外诊断能力（如UPD、ROH和三倍体检测）。等臂可从单例ES检测，但识别异臂通常需双人或三人家系测序。ROH检测已常规实施于ES流程，可增强CNV调用者敏感性。还显示三倍体可通过ES等位基因频率分析可靠检测，绘制B-等位基因频率并搜索双峰分布，代表超越传统读深分析的显著改进。因此，CMA所有主要诊断效用均可由ES实现，且分辨率增强。

以CMA启动测试的限制是CNV识别可能排除后续ES，潜在遗漏致病SNV，偶尔导致CNV误解为不完全外显或良性。因ES可单 assay检测SNV和CNV，减少误诊风险，实现更全面高效遗传评估。

ES的伦理、法律和社会影响（ELSI），尤其产前诊断中，需谨慎前瞻考虑。特别父母请求启动产前ES（无结构异常或明确HPO术语） presents临床效用、变异解释和伦理论证挑战。无表型指导，识别VUS可能性增加，可致显著情绪负担、焦虑和潜在误解。因此在此设置中仅报告P/LP变异；本研究中CMA和ES数据比较的CNV仅临床指示时报告家庭。另一关键考虑公平和访问。产前ES可能无意加剧健康不公平，尤其服务不足人群。随着ES产前设置日益采用，持续研究和政策发展必要以地址这些ELSI关注。整合强大伦理框架与技术先进将是确保产前诊断中ES使用保持临床负责和社会 accountable的关键。

未来，WGS在临床实验室更广泛采用预期克服ES许多限制，尤其非编码和复杂基因组区域CNV检测。但直至WGS更广泛可用和经济高效（测序和数据存储），研究发现强烈支持ES作为一线诊断测试，能单 assay高效检测SNV和CNV。

作者贡献

R.B., M.S., A.F., H.M.-S., and, T.H.: 概念化和设计；S.Z. and CR.: 数据生成；R.B., M.S., O.E., V.M., and, A.F.: 生物信息和数据解释；I.L., I.A., S.G.: 计算分析；J.R., H.D., O.E., and, V.M.: 临床数据和解释；R.B., M.S., H.M.-S., and, T.H.: 手稿草稿；所有作者阅读和修改手稿。

致谢

作者感谢家庭和转诊医生。

伦理声明

研究经本地伦理委员会批准（协议HMO-0117-25）。

同意

所有家庭签署外显子测序知情同意。

利益冲突

H.M.-S. 是Geneyx Genomics Ltd.员工。