单分子DNA镊子可通过任意分子信号实现对酶活性的可编程控制

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：Single-Molecule DNA Tweezers Enable Programmable Control of Enzyme Activity via Arbitrary Molecular Cues

单分子DNA tweezers（SMDTs）通过非共价结合酶的两个位点实现可编程调控，无需酶结构修饰，响应化学信号恢复活性。测试了核酸、转录因子、生长因子、抗生素及金属离子等触发分子，显示高特异性与灵敏度，在血清中功能稳定，为合成生物学与生物传感提供新工具。

　　本研究提出了一种全新的DNA纳米技术策略，即单分子DNA镊子（Single-Molecule DNA Tweezers, SMDTs），用于实现对酶活性的程序化、可逆调控。这一方法的核心在于利用DNA的结构特性，通过非共价结合的方式，将两种不同的DNA适配体连接起来，从而在无需对酶本身进行任何结构修饰的前提下，实现对其功能的精准控制。这种设计不仅简化了合成过程，还增强了系统在复杂生物环境中的兼容性，为未来的生物医学应用提供了新的可能性。

SMDTs的基本结构由两个适配体和一个可调控的DNA连接区域组成。适配体是能够特异性识别并结合到目标酶上的分子片段，而连接区域则负责在特定分子信号的作用下发生构象变化。当SMDT与酶结合时，其“夹紧”构象会阻止酶的活性，使其处于“关闭”状态。然而，当引入特定的分子信号（如互补的核酸、蛋白质、小分子或化学活性物质）后，连接区域的构象会发生改变，使得其中一个适配体脱离酶，从而恢复其活性，进入“开启”状态。这种机制模仿了天然的别构调控过程，即酶在不同配体结合后发生构象变化，进而影响其功能。

该研究选择凝血酶（thrombin）作为模型酶，以验证SMDTs的功能。凝血酶在血液凝固过程中起着关键作用，其活性受到多种分子信号的调控。研究人员利用凝血酶的两个已知结合位点——纤连蛋白结合位点和肝素结合位点——分别设计了两个适配体（A15和A29），并将其通过一个可变长度的DNA连接区域连接起来。这种设计的关键在于，连接区域的长度、序列、柔韧性和几何形状可以被精确调控，从而影响SMDT对酶的抑制和激活效果。通过调整这些因素，研究人员发现SMDTs可以在极低的浓度下实现对凝血酶的高效抑制，而传统方法往往需要高达2000 nM的浓度才能达到类似的抑制效果。

SMDTs的调控机制具有高度的灵活性和可编程性。研究人员展示了其对多种分子信号的响应能力，包括核酸、转录因子（如TATA结合蛋白TBP和细胞c-Myc蛋白）、信号蛋白（如血小板衍生生长因子PDGF）、小分子（如链霉素kanamycin）和金属离子（如Mn2?）。例如，当引入互补的核酸序列时，这些序列能够与SMDT中的识别区域发生特异性结合，导致连接区域的刚性增加，从而破坏适配体之间的协同作用，使凝血酶重新获得活性。这一特性使得SMDTs能够在不同的生物环境中实现精准的调控，例如在5%的人类血清中仍然能够有效工作。

此外，SMDTs还能够响应分子的化学活性，而不仅仅是其浓度。研究人员设计了一种SMDT结构，其中连接区域包含一种能够被Mn2?激活的DNA酶（DNAzyme）的底物链。在没有Mn2?的情况下，DNA酶处于非活性状态，无法切割底物链，因此SMDT仍然保持其抑制凝血酶的活性。然而，当Mn2?被引入后，DNA酶被激活，开始切割底物链，从而导致SMDT的结构发生变化，适配体之间的协同作用被打破，凝血酶得以释放并恢复活性。这种基于化学活性的调控方式，为开发更复杂的生物传感系统和可控的分子装置提供了新的思路。

在研究中，研究人员还探讨了SMDTs对不同长度和序列的分子信号的响应情况。他们发现，只有当分子信号的长度足够长时，才能有效触发SMDT的构象变化，从而实现对酶的激活。例如，对于R15结构的SMDT，当引入长度为40 nt及以上的互补序列时，凝血酶的活性能够被显著恢复，而较短的互补序列则无法达到这一效果。这一发现强调了SMDTs在设计时需要考虑的结构刚性阈值问题，即分子信号必须具备足够的刚性才能有效打破适配体之间的协同作用。

通过一系列实验，研究人员验证了SMDTs在不同分子信号下的响应能力。他们发现，当SMDT与凝血酶结合时，其抑制效果与连接区域的长度密切相关。例如，R10结构的SMDT在1:1的凝血酶与SMDT比例下，仅能实现较弱的抑制效果，而R15结构的SMDT则能够实现高效的抑制。随着连接区域长度的增加，抑制效果在R30、R40和R50结构中逐渐增强，但在R60结构中又有所下降。这一现象表明，连接区域的长度并非越长越好，而是需要在一个特定的范围内，才能达到最佳的抑制效果。

SMDTs的多功能性使其在多个领域具有广阔的应用前景。例如，在生物传感方面，它们可以用于检测特定的分子信号，如蛋白质或小分子的存在；在合成生物学中，SMDTs可以作为可编程的分子开关，用于控制基因表达或代谢途径；在纳米医学中，它们可以用于靶向释放药物或调节细胞内的酶活性；在分子计算中，SMDTs可以作为逻辑门的构建单元，实现对复杂信号的响应和处理。这些应用不仅依赖于SMDTs对分子信号的高灵敏度，还依赖于其在不同生物环境中的稳定性和兼容性。

在实际应用中，SMDTs的优势在于其非共价结合机制，这使得它们能够在不破坏酶原有结构和功能的前提下实现对其活性的调控。此外，SMDTs的单分子设计也简化了其合成和操作流程，降低了实验的复杂性。然而，这一技术仍面临一些挑战，例如在复杂生物环境中的稳定性问题，以及如何进一步优化连接区域的长度和序列，以提高其响应效率和特异性。因此，未来的研究需要在这些方面进行深入探索，以完善SMDTs的功能并拓展其应用范围。

总的来说，SMDTs的提出为实现对酶活性的程序化调控提供了一种全新的策略。与传统的蛋白质工程方法相比，SMDTs不仅避免了对酶结构的破坏，还具有更高的灵活性和可编程性。通过调整连接区域的特性，研究人员能够设计出能够响应不同分子信号的SMDT结构，从而实现对酶活性的精准控制。这一成果不仅在基础科学研究中具有重要意义，还为未来的生物医学技术发展提供了新的工具和思路。随着相关研究的不断深入，SMDTs有望成为一种广泛使用的生物调控平台，推动更多前沿领域的创新应用。