基于低温凝胶化技术的载人间充质干细胞形状记忆支架：力学响应与软骨再生新策略

本文报道了一种通过低温凝胶化技术制备的载人间充质干细胞（hASC）明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）形状记忆支架（SMS），该支架在60%循环压缩应变下能显著上调机械敏感基因（WNT、PIEZO1、TRPV2、YAP/TAZ等），为可注射式组织工程提供了兼具力学响应性与生物活性的创新平台。

　　

1 引言

微创再生策略推动了形状记忆支架（SMS）的发展，这类材料能够在原位发生可逆变形和结构展开。其中通过冷冻干燥形成的低温凝胶因其大孔结构和固有弹性而具有独特优势，能够在水合作用下实现快速形状恢复。这种转变主要受孔隙几何形状控制，根据达西定律，孔隙率和孔径共同决定了流体吸收速率和形状恢复动力学。

然而大多数SMS系统仅限于无细胞多孔结构，主要关注结构力学，在组织再生中的应用有限。无细胞SMS的主要限制是其生物活性不足，这阻碍了它们主动参与组织重塑、细胞外基质（ECM）产生或旁分泌信号传递的能力。此外，无细胞系统通常仅依赖宿主细胞浸润，这对于复杂或大组织缺损的再生来说可能缓慢、不一致或不足。细胞表现出机械传导特性，其活性在适当的外部机械刺激下会增强。尽管无细胞SMS具有优异的形状记忆特性，但在没有细胞植入的情况下，直接向细胞传递循环机械刺激仍然存在重大障碍。

为了克服无细胞SMS的局限性，活细胞的植入已成为先进SMS系统的关键策略。特别是，载细胞SMS必须在构建体制备和暴露于循环机械刺激后保持高封装细胞活性和稳定的生物功能。然而，载细胞低温凝胶SMS的制备仍然具有挑战性，因为严酷的冻融过程涉及低至–80°C的温度暴露，以及冷却速率和其他加工条件等关键参数，如果控制不当可能会损害细胞活力。此外，实现形状记忆特性通常需要高度交联或弹性，这可能与最佳细胞行为所需的柔软度和水合作用相冲突。

2 结果与讨论

2.1 形状记忆载细胞多孔GelMA构建体的制备与应用

研究提出了通过低温凝胶化过程制备可低温保存的载细胞明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）基SMS，使用二甲基亚砜作为冷冻保护剂。该过程使载细胞构建体能够实现精细可调的孔隙率、快速形状恢复和高干细胞存活率保留。为了证明SMS作为载细胞构建体在组织工程应用中的可行性，将人间充质干细胞（hASC）封装在这些支架内。在循环压缩应变下，这些构建体有效地将机械信号传递给嵌入的细胞，机械传导相关基因（包括WNT、PIEZO1、TRPV2和YAP/TAZ）的表达上调证明了这一点。该制备策略进一步扩展到基于细胞外基质（ECM）的复合生物墨水，例如载hASC的胶原/GelMA和脱细胞ECM/GelMA配方，两者都表现出强大的形状记忆特性，同时保持高细胞活力。

材料特性示意图显示了GelMA和二甲基亚砜（DMSO）的特性，这些特性使得能够制备形状记忆载细胞支架。GelMA是一种可光交联且生物相容的水凝胶前体，含有RGD基序和基质金属蛋白酶敏感位点，从而增强细胞粘附和酶降解能力。甲基丙烯酸功能化骨架能够实现紫外线（UV）诱导的交联，其固有的拉伸性、剪切稀化行为和热响应性已应用于各种生物制造过程。此外，GelMA生物墨水中的DMSO可作为有效的冷冻保护剂。DMSO在低温条件下维持细胞活力的生物相容性支持将活细胞纳入GelMA基质，并保留冻融后的生物功能。DMSO被加入GelMA生物墨水中作为冷冻保护剂，以促进细胞在低温处理过程中的存活。

提出的低温凝胶化过程示意图显示了获得具有形状记忆特性的载细胞多孔GelMA结构的过程。将含有hASC、冷冻保护剂（10 v/v% DMSO）和光引发剂（0.1 wt% LAP）的GelMA水凝胶（3 wt%）从初始温度（T_i=10°C）到最终温度（T_f=?80°C）进行低温凝胶化和UV交联（5 mW，40 s）。在此过程中，冰晶作为物理致孔剂，在融化后形成相互连接的大孔网络。由此产生的多孔结构的形态直接受冰形成动力学的影响。快速的冰成核产生大量小晶体，产生减小的孔径，而缓慢的冰生长可能导致相对较大的孔隙。因此，应选择适当的冰成核和生长以获得具有形状记忆特性的有效孔结构。

为了证明载细胞SMS的可行性，示意图显示了将载细胞形状记忆GelMA SMS关节内递送用于软骨缺损修复。如示意图所示，将SMS注入膝关节股骨关节软骨中手术诱导的软骨缺损处。为了可视化植入，使用特氟龙管辅助注射系统将可注射GelMA SMS精确植入3D打印的股骨髁内的缺损部位。图像显示了使用显微外科技术操纵和放置SMS的临床可能性。

2.2 不同低温凝胶参数下GelMA SMS的制备与表征

低温凝胶过程受最终冷冻温度、冷却速率和水凝胶浓度等制造参数的严重影响。这些参数共同决定了制造孔结构的孔径、互连性、曲折度和机械强度。在本研究中，GelMA的浓度（3 wt%）是固定的。虽然相对较高的GelMA浓度增强了多孔结构的机械强度，但高浓度也可能禁止有效的细胞活动，包括在多孔结构中负载的细胞的增殖。此外，低温保存时间固定为2小时，以观察最终冷冻温度和冷却速率的影响。

首先，为了观察冷冻温度（?15至?80°C）对载细胞多孔结构形成的影响，固定初始温度（10°C）和冷却速率（?1°C min^?1）。打印的圆柱形模具（直径=5 mm，高度=3 mm）由聚乳酸（PLA）制成，生物墨水配方包含3 wt% GelMA、0.1 wt% LAP、10 v/v% DMSO和5×10⁶ hASCs mL^?1悬浮在补充有10 v/v% FBS和1 v/v% PS的DMEM-低葡萄糖中。将生物墨水分配到圆柱形PLA模具中，进行控制冷冻至目标温度，随后在紫外光（5 mW，40 s）下交联，并在预温（37°C）细胞培养基中解冻，以制备载hASC的GelMA SMS。

所有结构都表现出高度多孔和互连的孔网络，这是冰模板低温凝胶化的典型结果。这种热力学诱导的快速和广泛的冰成核由以下方程确定：J≈exp[–ΔG/kT_abs]，其中J、G、k和T_abs分别是冰成核速率、核形成的临界吉布斯自由能垒、玻尔兹曼常数和绝对温度。当T_i和T_f之间存在大的温差时，临界自由能垒（ΔG*）降低，导致冰成核速率增加和冰晶孔径减小。结果，几乎同时形成大量小冰晶。这些晶体在低温凝胶化过程中充当精细的致孔剂，小冰晶单独占据的体积较小，并在解冻后在水凝胶中产生更小、分布更密集的孔隙。从扫描电子显微镜（SEM）图像中，测量了多孔结构的孔隙面积。随着冷冻温度的降低，在恒定冷却速率下，孔隙面积略有减少；然而，低于?35°C时，与?80°C相比，孔径没有显著差异，因为冰成核速率可能变得饱和。这意味着大多数成核事件已经发生；因此，进一步降低温度不会增加冰核的数量。因此，选择?80°C作为冷冻条件，确保实用且可重复的工作流程，无需额外设备要求。

通常，多孔结构对于促进快速的毛细管驱动液体吸收和在水合作用下实现快速形状恢复至关重要。为了评估水触发的形状记忆行为，将多孔载细胞GelMA结构压缩至80%应变（φ），并在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中允许恢复。所有样品都迅速恢复了原始形状，从而证实了它们用于可注射递送的实际潜力。定量分析显示，多孔结构在所有组中迅速保持了高质量的形状恢复比率（>95%），从而验证了其结构设计的有效性。

此外，测量了在不同冷冻温度下制造的多孔结构的压缩模量。在较低冷冻温度（–35至–80°C）下制造的GelMA低温凝胶表现出相对较高的压缩模量（≈19 kPa）， compared to those prepared at –15°C (≈12 kPa)。模量的增加可归因于在较低温度下更大的过冷度，这促进了更小和更多冰晶的形成。这导致更小的孔径，增强了多孔结构的抗压阻力。因为孔径和孔隙率在许多低温凝胶中正相关（较大的孔隙≈较高的孔隙率），模量可以根据Gibson-Ashby方程与孔径成反比：E ∝ E_s(1–φ)ⁿ，其中E是多孔结构的有效模量，E_s是实体结构的模量，φ是孔隙率，n是经验指数（对于开孔通常为2）。

此外，使用活（绿色）/死（红色）染色评估了封装在GelMA结构中的hASC在制造后的活力。GelMA多孔结构中的大多数细胞是存活的，表明低温凝胶化过程和冻融循环都没有由于适当的冷冻保护剂浓度而对细胞存活产生不利影响。定量活力分析进一步支持了这一点，显示所有组中活细胞的百分比 consistently high (>85%)。基于这些结果，低于–35°C的冷冻温度导致适当的孔隙面积、增强的压缩模量（18±2.5 kPa）和合理的细胞活力（86±3%）。适当地，冷冻、最终和起始温度分别固定为–80和10°C。

在不同冷却速率（–4、–2、–1和–0.5°C min^?1）下制造的多孔结构的横截面SEM图像显示了孔隙结构的形态差异，证明了冷却速率对多孔结构的影响。在相对较慢的–1和–0.5°C min^?1冷却速率下，载细胞低温凝胶表现出比在较快冷却速率（–4和–2°C min^?1）下相对更大的多孔结构。相比之下，在–4和–2°C min^?1下形成的孔结构显示出相对更细的孔隙和非均匀的孔网络，如代表性图像所示，并通过小孔区域（SPR）和大孔区域（LPR）的孔隙面积分布进行定量评估。这种非均匀微观结构可能阻碍有效的形状记忆特性、有效的营养扩散甚至细胞生长，使其不太适合生物活性应用。从热力学和动力学角度来看，快速冷却速率可能导致快速过冷，从而促进大量小冰晶的均匀成核。

此外，因为孔隙率影响形状记忆特性，测量了使用不同冷却速率制造的多孔结构的孔隙率。正如预期，低温凝胶化过程中较慢的冷却导致相对较高的孔隙率，而较快的冷却由于冰晶生长速率不同而产生较小的孔隙率。

然而，在我们的载细胞GelMA系统中，制造的孔隙表现出非均匀分布。预期的均匀细孔结构与观察到的载细胞GelMA中非均匀孔隙分布之间的差异可能是由于非均匀温度分布或存在细胞和DMSO的GelMA基质异质性造成的，从而影响局部扩散和冰传播。

为了评估低温凝胶的形状记忆行为，在80%压缩应变（φ）下进行了循环压缩测试。在相对较快冷却速率（–4和–2°C min^?1）下制造的低温凝胶表现出受损的机械恢复， due to their nonhomogeneous pore structures。这些不规则结构导致整个基质中应力分布不均匀， resulting in localized deformation and reduced structural resilience。相比之下，在较慢冷却条件（–1和–0.5°C min^?1）下制备的低温凝胶表现出稳定且可重复的形状记忆特性。这归因于它们更大且均匀的孔网络， which facilitate uniform stress dissipation and elastic recovery。

在这项使用载细胞生物墨水的工作中，负载在GelMA结构中的细胞活力是确定适当冷却速率的重要参数。第1天的活/死染色显示，在相对较慢冷却速率（–1和–0.5°C min^?1）下制造的多孔结构比在较快冷冻速率（–4和–2°C min^?1）下制备的结构支持明显更多的存活细胞。量化证实了这一观察结果，显示通过缓慢冷却形成的多孔结构中的细胞活力超过85%，而在快速冷冻组中则显著下降。这可能是因为在冰形成过程中，较大的孔隙通常来自较慢、更受控制的冰晶生长，这对嵌入的细胞施加的物理应力较小。相比之下，较小或快速形成的冰晶，常见于非均匀或高度过冷区域，产生尖锐的冰-基质界面， physically disrupt cell membranes and cause freezing-induced injury。

为了进一步评估在不同冷却速率下制造的载细胞多孔胶原结构内的细胞活性，在第7天进行了表面和横截面DAPI（蓝色）/F-肌动蛋白（绿色）染色。如制造的多孔结构表面所示，细胞核总数相似；然而，在较慢冷却速率下制造的多孔结构中，F-肌动蛋白面积扩展得更多。此外，在横截面区域，封装在较慢冷却速率（–1和–0.5°C min^?1）下形成的结构中的细胞表现出高活力和良好组织的细胞骨架结构。相比之下，在较快冷却速率（–4和–2°C min^?1）下制造的结构显示出减少的F-肌动蛋白组织和较少发展的细胞骨架形态。这些结果是可以预测的，因为冷却速率直接影响细胞活动。使用MTT assay评估了结果。

基于这些结果，–1°C min^?1是工程化具有合理细胞活性和精确孔隙特征的多孔结构的适当冷却速率，能够实现快速、可逆和可靠的形状转变。

2.3 低温凝胶制备的载细胞胶原SMS的形状记忆和生物功能特性评估

为了证明通过低温凝胶化制造的载细胞多孔GelMA结构的可行性，将其性能与常规载细胞GelMA水凝胶（对照）进行了比较。对照是通过将GelMA注入模具中然后交联而不进行低温凝胶化的简单程序制造的。为了评估载hASC的GelMA-SMS（AG-SMS），测量了形状记忆特性、孔结构、初始细胞活力和细胞增殖。压缩-释放测试的图像显示，对照水凝胶在80%压缩应变下发生不可逆变形，而AG-SMS在水性条件下释放后完全恢复了原始形状。这些图像通过循环压缩测试得到定量支持。AG-SMS表现出扩展的弹性变形范围，并显示出相对于对照的无滞后性能。这表明其保留弹性能量并从施加的应变中恢复而 without structural collapse。还通过循环测试（施加80%的单一应变）评估了结果。AG-SMS表现出比对照高得多的应变能恢复和显著降低的能量耗散。

使用SEM观察了对照和AG-SMS之间的形态差异。横截面形态和孔结构的图像揭示了主要的孔结构差异。对照表现出致密、无孔或松散形成的微纤维结构，而AG-SMS显示出高度组织化的大开孔网络，定量确认，这促进了孔驱动的形状恢复和增强的营养和流体运输到封装的细胞。

第1天对照和AG-SMS的活/死染色显示，AG-SMS中的负载细胞存活率显著低于对照。然而，AG-SMS的活力是合理的（85%），尽管低温凝胶化可能造成了一些细胞损伤。此外，使用MTT assay评估了细胞增殖。尽管AG-SMS中的初始细胞活力略低于对照，但由于AG-SMS的增强微环境，封装细胞在AG-SMS内表现出显著增强的增殖速率，这归因于精确且均匀的孔隙几何形状。

2.4 AG-SMS中的循环机械刺激和细胞反应

为了评估机械负载对细胞行为的影响，对AG-SMS施加了一系列循环压缩应变（10%、40%、60%和80%），频率为0.5 Hz，每天1小时。封装的hASC密度保持在5×10⁶ cells mL^?1。如支持信息表S1所总结，结合压缩和剪切的多轴负载系统 consistently enhanced chondrogenic markers and matrix deposition。然而，单轴压缩模型也 demonstrated positive effects，尽管结果 strongly dependent on loading parameters。因此，我们的单轴处理（0.5 Hz，1 h day^?1）可以为研究机械传导提供可靠的基线条件。

在每个机械条件下，通过第1天和第7天的活/死染色评估细胞活力。尽管在第1天各组之间没有观察到存活率的显著差异，但暴露于80%循环应变7天导致细胞存活率显著下降。这表明过度的压缩应力（80%应变）损害了细胞活力。基于结果，选择≤60%的压缩应变阈值进行进一步分析。

如示意图所示，机械刺激旨在模拟动态生理负载条件并诱导嵌入细胞中的机械响应信号。特别是在机械压缩下，细胞膜变形触发细胞内钙流入，导致细胞骨架聚合。这种机械信号促进了转录共激活因子yes-associated protein（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）从细胞质到细胞核的易位。此外，在细胞核中，YAP/TAZ与转录增强关联域转录因子形成复合物，从而促进下游机械敏感基因的转录。同时，压缩应力也激活WNT/β-catenin信号通路， thus allowing cytoplasmic β-catenin to translocate into the nucleus。

为了探索细胞骨架重塑和机械敏感标志物的表达，在7天机械刺激后进行了F-肌动蛋白、 vinculin（VCL）和piezo型机械敏感离子通道组件1（PIEZO1）的免疫荧光染色。具体来说，VLN通过将整合素连接到肌动蛋白细胞骨架来促进粘着斑 reinforcement in response to internal cytoskeletal tension，而PIEZO1，一种拉伸激活离子通道，通过介导钙流入和下游信号响应膜变形。增加循环压缩应变导致VLN和PIEZO1的表达上调，表明 active mechanotransduction response。

这些观察表明，VLN和PIEZO1的表达升高反映了细胞对压缩负载的适应性反应，通过促进结构稳定和触发与发育和修复相关的信号级联。值得注意的是，这些包括丝裂原活化蛋白激酶、磷酸肌醇3-激酶/蛋白激酶B和WNT/β-catenin通路，所有这些都控制重要的细胞过程，如增殖、分化和组织再生。为了确认这些通路的转录激活，进行了定量实时PCR（qRT-PCR）来评估PIEZO1、TRPV2、TRPC6、YAP、TAZ、TEAD、WNT和β-catenin的表达。40-60%范围内的应变条件 considerably upregulated these mechanosensitive genes relative to the 0% strain group。定性电泳进一步支持了这些结果，验证了对循环压缩的机械传导反应。

结果表明，高达60%的循环压缩应变增强了细胞骨架组织并激活了机械传导通路， thereby establishing a mechanically favorable microenvironment for tissue regeneration。虽然 prolonged stimulation is often associated with cellular damage and reduced viability，我们对在每天60%循环应变下培养在生物构建体中的hASC的评估 revealed no decline in cell viability。相反，F-肌动蛋白阳性区域逐渐增加， indicating sustained cytoskeletal organization and cellular growth over 14 days of stimulation。这些发现表明，60%循环应变即使在相对长期的刺激下也不会诱导细胞损伤。

为了确定PIEZO1的机械激活是否有助于有利的下游机械传导，我们通过结合两个变量建立了四个实验组：PIEZO1抑制和机械刺激。使用GsMTx-4（5 μM）药理阻断PIEZO1活性，在传代培养期间应用，并在生物构建体制造后持续维持以确保持续抑制。该设计使我们能够 specifically assess whether compressive loading activates PIEZO1 and, in turn, promotes downstream signaling cascades such as the Hippo pathway (YAP, TAZ, TEAD) and the WNT/β-catenin pathway。

PIEZO1免疫荧光染色和定量分析 revealed a significant reduction in PIEZO1 expression in groups treated with GsMTx-4 (treated PIEZO1: PIEZO1^KO)。有趣的是，虽然机械刺激 tended to increase PIEZO1 expression，这种变化没有统计学意义， indicating successful inhibition of stretch-activated ion channels。

为了验证对机械传导的下游影响，在培养3天后测量了与拉伸激活离子通道、Hippo信号通路和WNT/β-catenin通路相关的相对基因表达水平。编码拉伸激活离子通道（PIEZO1和TRPV2）的基因在GsMTx-4处理后显著下调， confirming effective channel blockade。正如预期，未经处理的hASC在机械刺激下表现出机械传导相关基因的显著上调。相比之下，GsMTx-4处理组在大多数机械传导相关基因中没有显示显著增加。

2.5 形状记忆胶原/dECM-GelMA构建体的开发及其软骨形成潜力

成功制造了基于GelMA的载hASC SMS，并确认了其通过循环压缩应变激活的机械敏感信号通路促进组织再生的潜力。为了克服GelMA材料固有的局限性，例如有限的生物活性，通过将胶原或软骨来源的dECM纳入GelMA来开发复合生物墨水，以制造具有保留形状记忆特性的多孔载hASC SMS。

软骨来源的dECM通过酶消化和脱细胞从猪耳软骨制备。如量化结果所示，观察到DNA和糖胺聚糖含量显著减少，而胶原含量 largely retained。将获得的dECM（1 wt%）和I型胶原（Col）（1 wt%）与载hASC的GelMA（2 wt%和5×10⁶ cells mL^?1）混合。SEM图像显示，由dECM和胶原组成的 resulting SMSs exhibited a porous and fibrous microarchitecture。

如支持信息表S2所总结，已经报道了各种分析技术来评估生物材料降解，结果可能因所用方法而异。在我们的研究中，浸没在PBS中的GelMA、Col/GelMA和dECM/GelMA构建体的SEM图像显示出相似的降解模式。虽然所有组在第0天保持相对完整的结构，但到第7天，明显的表面侵蚀和内部坍塌变得明显，表明水解分解和溶胀效应加速了该阶段的降解。到第14天，构建体表现出进一步的孔隙率和连续性丧失， showing that the bulk structural integrity of these hydrogels diminishes once degradation initiates。

载hASC SMS构建体（GelMA、Col/GelMA和dECM/GelMA）在压缩应变（60%）下的光学图像显示，多孔结构即使在60%压缩后也保持了完整性，并在释放后恢复到原始形状， thus confirming excellent elastic recovery。循环压缩测试（60%）进一步证明了在10个重复循环中可重复的形状恢复， indicating robust fatigue resistance and structural resilience。

此外，定量压缩循环分析显示，将胶原或dECM加入GelMA生物墨水中显著降低了压缩模量， likely because of the intrinsically lower stiffness of the natural ECM and collagen components。

为了评估它们的软骨形成能力，使用GelMA、胶原/GelMA和dECM/GelMA生物墨水生物打印了载细胞SMS构建体。生物打印和低温凝胶化后，活/死染色 confirmed the reasonable cell viability (83±2%) in all groups，表明打印过程中的细胞毒性最小。此外，F-肌动蛋白和III型胶原染色显示，与仅GelMA的对照组相比，胶原/GelMA和dECM/GelMA构建体中的细胞骨架组织和细胞外基质沉积显著改善，表明胶原和dECM的 incorporation provides a more biomimetic microenvironment conducive to cell adhesion, spreading, and chondrogenic commitment。

通过量化谱系特异性基因表达评估了21天的软骨形成分化。用dECM/GelMA制造的构建体表现出关键软骨形成调节因子（SOX9、II型胶原alpha 1（COL2A1）和ACAN）的显著 higher expression，与仅GelMA和胶原/GelMA SMSs相比。此外，在dECM/GelMA生物构建体中观察到软骨特异性结构和基质相关基因、软骨寡聚基质蛋白、透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1（HAPLN1）和蛋白聚糖4（PRG4；lubricin）的显著上调。这些转录趋势通过定性电泳分析得到进一步验证。基于结果，dECM/GelMA生物构建体可以重现软骨样微环境， thereby promoting robust chondrogenesis。

除了关节软骨应用，该策略还具有用于其他机械动态组织（如肌腱和椎间盘）的潜力，其中持续的机械负载、基质组织和谱系特异性分化对于功能再生至关重要。因此，基于dECM的构建体结合结构支持和生物活性信号的能力可以在适当的机械刺激下用于指导肌腱或髓核分化，拓宽该平台的转化范围。

3 结论

在这项研究中，通过将hASC整合到低温凝胶化的GelMA基基质中，成功开发了 fully biofunctional cell-laden SMS。通过系统优化低温凝胶化参数（特别是冷冻温度和冷却速率），实现了大孔结构，能够实现快速水触发形状恢复、支持高细胞活力（>85%）和维持细胞功能。重要的是，制造的SMS在循环压缩刺激下表现出强大的细胞机械传导，关键机械敏感标志物（如YAP/TAZ、WNT和PIEZO1）显著上调。这表明支架有潜力通过机械信号指导谱系特异性分化。将该平台扩展到复合生物墨水，包括胶原/GelMA和dECM/GelMA，进一步改善了细胞增殖和机械敏感基因表达， thereby confirming the generalizability of the fabrication approach and the biological significance of matrix-derived biochemical signals。这些结果通过 enabling mechanical responsiveness and biologically active cell delivery within a single construct 解决了无细胞SMS系统的局限性。因此，这种基于低温凝胶的制造策略代表了一种有前途的微创组织工程范式。通过统一结构适应性、形状记忆特性和机械响应细胞编程，该平台在机械动态环境中的再生应用具有巨大潜力，其中同步的机械和生物性能对于成功的组织修复和整合至关重要。

4 实验部分

明胶的甲基丙烯酰化

根据先前描述的方案制备明胶的甲基丙烯酸酯。简要地说，来自猪皮的明胶（300 g，Bloom；Sigma–Aldrich）溶解在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（10 w/v%）中。在50°C连续搅拌下滴加甲基丙烯酸酐（Sigma Aldrich）。2小时后，使用透析管在40°C的蒸馏水中透析GelMA三天，以去除剩余的甲基丙烯酸酐。此后，通过0.22μm syringe filter（Thermo-Fisher Scientific）过滤对GelMA水凝胶进行灭菌。将GelMA冻干以用于进一步实验。

细胞和GelMA生物墨水的制备

将hASC（PT-5006；Lonza）在补充有10 v/v%胎牛血清（Biowest）和1 v/v%青霉素/链霉素（Thermo-Fisher Scientific）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-低葡萄糖（HyClone Laboratories）中，在37°C、5% CO₂气氛下培养。每两天更换一次培养基。

为了制备SMS支架，将冻干的GelMA溶解在DMEM-