中国候鸟腺病毒的分子特征揭示其重组与宿主交换现象

本文通过对中国九省候鸟粪便样本的系统研究，首次大规模揭示了禽腺病毒（Avian Adenoviruses）在迁徙鸟类中的流行特征与遗传多样性。研究发现高达67.2%的DNA聚合酶序列与已知序列同源性低于85%，表明存在大量潜在新物种；同时通过系统发育与重组分析证实了跨物种传播（host exchange）和基因重组（recombination）事件，为野生鸟类与家禽间病毒传播及新病毒 emergence 机制提供了重要分子流行病学证据。

　　

1. 引言

腺病毒（Adenoviruses）是一类中等大小、无包膜、线性双链DNA病毒，属于腺病毒科（Adenoviridae），基因组大小约27–48 kb，两端具有反向末端重复序列（ITR）。目前腺病毒分为六个属，包括禽腺病毒属（Aviadenovirus）、蝙蝠腺病毒属（Barthadenovirus）、鱼腺病毒属（Ichtadenovirus）、哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）、蛙腺病毒属（Siadenovirus）和龟腺病毒属（Testadenovirus）。

腺病毒广泛感染人类和动物，在人类中通常引起轻微感染，包括呼吸道疾病、胃肠道疾病和结膜炎等。鸟类因其物种多样性、迁徙行为和独特的免疫系统，成为腺病毒传播和进化的天然储存库。中国位于全球九大候鸟迁徙路线中的三条上，拥有全球五分之一的候鸟种类，东亚-澳大利亚迁徙路线是中国最重要的候鸟迁徙路径。然而，中国对野生鸟类腺病毒的研究仍较为缺乏。

2. 材料与方法

2.1. 样本采集

研究于2020年10月至2021年3月期间，从中国九个省份的候鸟栖息地采集新鲜粪便样本，包括黑龙江兴凯湖、河北沧州、青海隆宝自然保护区、云南大观公园和滇池、福建闽江口、宁夏灵武市、湖北网湖、内蒙古图牧吉国家级自然保护区以及西藏雅鲁藏布江沿岸县市。样本采集后保存在含青霉素（0.2 mg/mL）、链霉素硫酸盐（2 mg/mL）和甘油（20%）的防腐液中，于-80°C保存。

2.2. 核酸提取

使用天隆病毒DNA/RNA提取试剂盒或QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit进行总核酸提取。样本预处理采用玻璃珠破碎法以提高提取效率，并添加MS2噬菌体和Phocine疱疹病毒作为外控标。

2.3. PCR引物设计与扩增

采用嵌套PCR扩增腺病毒DNA聚合酶基因（约300 bp），使用已发表的泛腺病毒引物。针对禽腺病毒属和蛙腺病毒属的hexon基因设计特异性引物，扩增约1000 bp片段。鸟类线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因用于物种鉴定，扩增约450 bp片段。所有PCR反应均设置阳性和阴性对照，产物经测序验证。

2.4. 系统发育分析与基因表征

使用MAFFT和PhyML软件基于DNA聚合酶氨基酸序列构建最大似然树。采用SplitsTree v4.18.3构建NeighborNet网络，使用Dendroscope v3.8.2生成共进化树。

2.5. 重组分析

使用RDP4软件中的RDP、Bootscan、MaxChi、GENECONV、Siscan、Chimaera和3Seq方法，基于hexon基因进行重组分析。至少两种方法显示显著p值的事件被视为潜在重组事件。

2.6. 聚类分析

基于DNA聚合酶基因序列，使用cd-hit软件的CD-HIT-EST模块进行聚类分析，序列一致性阈值设为0.85，覆盖率设为0.9。

2.7. 统计分析

使用SPSS v26.0进行卡方检验，比较不同地区腺病毒检测率的差异，p<0.05视为显著。

3. 结果

3.1. 腺病毒检测与鸟类鉴定

共采集690份样本，来自38种候鸟，涵盖11科6目。总体腺病毒检出率为18.4%（127/690），其中禽腺病毒属占11.3%（78/690），蛙腺病毒属占6.2%（43/690），蝙蝠腺病毒属占1.3%（9/690）。云南地区检出率最高（40.7%），青海最低（6.1%）。禽腺病毒在所有九个地点均有检出，蛙腺病毒在八个地点检出，蝙蝠腺病毒仅在四个地点检出。

3.2. 系统发育分析与遗传特征

DNA聚合酶序列的系统发育分析显示，大多数禽腺病毒分为三个群组：一个群组与鹅腺病毒4和鸭腺病毒2聚类，另两个群组形成新的分支。67.2%（88/131）的序列与已知序列同源性低于85%，表明存在潜在新物种。蛙腺病毒和蝙蝠腺病毒也显示出类似的高多样性。

3.3. 重组分析

共进化树显示DNA聚合酶与hexon基因的对应关系，但属内存在交叉关系。重组分析识别出多个重组事件，例如天鹅腺病毒FJ06是鸭腺病毒2与斑头雁腺病毒XZ02的重组产物。

3.4. 潜在新腺病毒的聚类分析

88条低同源性序列可能属于39个不同物种，包括22个禽腺病毒物种、12个蛙腺病毒物种和5个蝙蝠腺病毒物种。最常见的蛙腺病毒物种有29条序列，全部来自雁形目鸟类。

4. 讨论

本研究揭示了候鸟腺病毒的高度多样性和潜在新物种的存在。系统发育和重组分析表明，腺病毒在鸟类中存在广泛的宿主交换和基因重组事件。候鸟的迁徙行为促进了病毒的远距离传播和进化，增加了野生鸟类与家禽之间病毒传播的风险。这些发现强调了持续监测和深入研究腺病毒多样性和进化机制的重要性。

5. 结论

中国候鸟中存在多样且潜在的腺病毒新物种，涉及至少10个物种。宿主交换和重组事件的发生凸显了野生鸟类与家禽之间病毒传播的潜力，强化了传染病控制中的"一体化健康" approach。未来的病原体监测和宏基因组测序将有助于全面了解这些新病原体的遗传特性。