中国II型猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）2024–2025年分子流行病学、谱系进化动态及抗原变异分析

本综述系统揭示了中国II型PRRSV在2024–2025年间的分子流行病学特征与进化动态，发现1.8谱系已成为主要流行株（占阳性样本48.5%），并鉴定出广东与河南为关键的病毒传播节点。研究通过系统发育、重组检测及抗原变异分析，揭示了当前流行株与疫苗株（如JXA1、CH-1R）之间存在抗原差异，ORF2-ORF3区域为潜在重组热点。该研究为制定靶向防控策略及优化疫苗设计提供了关键科学依据，对后非洲猪瘟时代中国养猪业的健康发展有重要意义。

　　

1. 引言

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的高度接触性传染病，自1987年在美国首次发现以来，已成为全球养猪业经济危害最严重的病原之一。中国作为世界最大的猪肉生产国和消费国，其养猪业尤其易受PRRSV传播的影响。北美型（II型）PRRSV的持续流行给中国猪群健康及产业经济带来持续挑战。自1995年首次传入中国以来，II型PRRSV经历了复杂的进化过程。2006年，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）的出现引发了灾难性疫情，导致数百万猪只死亡及巨大经济损失。然而近年来，以NADC30-like和NADC34-like亚谱系为代表的谱系1变种逐渐取代HP-PRRSV，成为中国新的优势流行谱系。

PRRSV表现出显著的遗传多样性和抗原变异能力，与其作为RNA病毒的特性密切相关。PRRSV基因组长度约为15 kb，包含约10个开放阅读框（ORFs）。其中，非结构蛋白2（nsp2）和主要囊膜糖蛋白（GP5，由ORF5编码）区域突变率最高，因此被广泛应用于分子流行病学研究。然而，关于PRRSV谱系在中国猪群中的动态进化机制及其对疫苗效力影响的系统研究仍较为有限，特别是在后非洲猪瘟时代，随着养猪业快速恢复和重建，新的挑战不断涌现。

值得注意的是，在2024–2025年期间，中国的II型PRRSV表现出新的流行病学特征。与以往时期相比，不仅病毒谱系多样性增加，重组事件和抗原漂移现象也显著加剧。NADC34-like谱系的快速扩张和跨区域传播尤其引起了业界的广泛关注。更令人担忧的是，市场使用的疫苗株（如JXA1、CH-1R和MLV）与野毒株之间的重组事件报道日益增多，可能影响疫苗安全性和效力，并可能产生具有新抗原特性或增强毒力的重组病毒。然而，迄今为止，对2024–2025年中国II型PRRSV的分子流行病学特征、谱系多样性及抗原变异的系统研究仍然稀缺，特别是关于新兴谱系的遗传变异模式、重组热点和抗原漂移机制的深入分析尤为缺乏。

为填补这一研究空白，本研究基于2024–2025年从中国27个省区采集的328份临床样本，采用全面方法包括全基因组测序、系统发育分析、重组检测和基于抗原变异分析，首次系统研究了中国II型PRRSV在此期间的空时动态、进化模式和抗原变异特征。研究发现中国存在五大主要谱系共存现象，其中谱系1.8为优势流行株，并鉴定出两个关键传播节点作为连接南北地区的"病毒交换中心"。抗原分析进一步揭示了当前疫苗株与主要流行谱系之间的抗原差异，这可能影响疫苗效力。通过本研究，我们旨在探究不同谱系间独特的宿主内单核苷酸变异（iSNV）模式，特别是在抗原相关区域，识别关键重组热点，并评估现有疫苗株与流行野毒株之间的抗原匹配度。该研究不仅填补了中国PRRSV分子流行病学研究的重要空白，还为制定靶向控制策略和优化疫苗设计提供了科学基础。此外，研究结果将有助于阐明PRRSV在中国猪群中的进化机制和抗原变异模式，为病毒适应性进化和免疫逃逸提供新视角。这些见解对后非洲猪瘟时代中国养猪业的可持续发展、疾病预防控制体系的完善以及生物安全水平的提升具有深远意义，最终将为保障国家粮食安全和促进猪肉生产行业的健康发展提供关键支持。

2. 材料与方法

2.1. 样本采集

在2024年至2025年期间，从中国27个省区表现出典型PRRS症状的猪只中共收集了328份临床样本。样本包括血清、肺组织、扁桃体和淋巴结，在无菌条件下采集并在4°C条件下运输至实验室进行后续处理。

2.2. ORF5基因扩增与测序

使用Vazyme Virus DNA/RNA Extraction Kit 2.0按照制造商说明提取病毒核酸。使用特异性引物PRRSV-GP5-F（5′-GTTTACCCAACGCTCCTTA-3′）和PRRSV-GP5-R（5′-ACTGGCGTGTAGGTAATGG-3′）通过RT-PCR扩增ORF5基因片段，该引物组先前已被描述并用于ORF5扩增。PCR反应体系（50 μL）包含：25 μL 2x Phanta Max Master Mix（Vazyme），1 μL正向和反向引物（10 μM各），5 μL模板核酸，以及18 μL去离子水。PCR热循环条件如下：98°C初始变性3分钟；98°C变性15秒，58°C退火30秒，72°C延伸45秒，共35个循环；最后72°C延伸10分钟。经1.5%琼脂糖凝胶电泳验证后，切取目标条带，纯化，并使用ABI 3730XL自动测序仪进行双向Sanger测序，获得完整ORF5基因序列。

2.3. 全基因组测序与数据处理

为进一步研究主要PRRSV谱系的进化动态、重组模式和抗原变异，我们从谱系1.8、3和8.7中选择了三个代表性毒株进行全基因组测序。这些毒株的选择基于其明显的系统发育位置和流行病学相关性。使用VAHTS Universal V8 RNA-seq Library Prep Kit for MGI构建测序文库。提取的RNA片段化后使用随机引物反转录成第一链cDNA，随后进行第二链cDNA合成、双链cDNA末端修复、dA加尾、接头连接、双轮珠式大小选择、PCR富集和文库纯化。纯化的文库使用Qsep100进行片段大小分布评估，并使用Qubit量化双链DNA浓度。合格的文库在MGISEQ-200测序仪DNBSEQ-T7平台上进行测序。原始测序数据使用FastQC进行质量控制，使用Trimmomatic进行质量修剪（参数：LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36）以去除低质量序列和接头污染。处理后的读段使用MEGAHIT进行从头组装（参数：—min-contig-len 200），得到的contigs通过与PRRSV参考序列数据库进行BLAST比对（E值阈值：1e-10）鉴定为PRRSV序列，最终获得完整的病毒基因组序列。

2.4. 系统发育分析

从GenBank数据库下载代表不同基因型和亚型的PRRSV参考序列。这些序列与本研究中获得的序列一起使用MAFFT进行比对（参数：—auto）。使用TrimAl去除低质量比对区域（参数：-automated1），随后进行人工校对以确保比对准确性。处理后的序列使用IQ-TREE进行最大似然（ML）系统发育分析，通过ModelFinder自动选择最佳替代模型，并通过1000次超快速自举重复评估分支可靠性。得到的系统发育树使用FigTree软件进行可视化和注释。

2.5. 传播分析

为阐明中国II型PRRSV谱系特异性传播动态，我们使用Nextstrain工具对亚谱系1.5、1.8和谱系3进行了空时分析。从GenBank检索了160条具有精确时间和地理注释的ORF5序列，包括20条来自亚谱系1.5的序列，108条来自亚谱系1.8的序列，以及32条来自谱系3的序列。这些与本研究生成的250条ORF5序列整合，对应相同谱系（L1.5=73，L1.8=164，L3=13）。410条序列的组合数据集使用TreeTime进行时间校准系统发育分析，以推断系统发育关系和传播历史，估计传播事件的时间和位置。

序列最初使用augur align命令进行比对以确保布局一致。使用IQ-TREE 2构建初步ML树，采用ModelFinder识别最佳替代模型。该ML树作为通过Augur输入TreeTime以生成时间分辨系统发育。地理元数据随后使用augur traits命令映射到系统发育上。最后，使用TreeTime联合估计所有内部节点的系统发育位置和祖先位置，从而能够详细评估每个谱系的空时传播模式。本分析检索的参考序列的详细信息在支持信息1：表S1中提供。

2.6. 多样性分析

使用DnaSP 6.0对2024年至2025年中国II型PRRSV ORF5序列进行遗传多样性分析。序列按谱系（1.5、1.8、3、5和8.7）分类并按采集年份（2024和2025）分组。计算每个谱系的各种遗传多样性参数，包括单倍型多样性（Hd）、核苷酸多样性（Pi）、多态位点数量（S）、总突变数（Eta）和平均核苷酸差异数（k）。采用滑动窗口分析（窗口长度：100 bp，步长：3 bp）识别ORF5基因内的变异热点。年份间的进一步分化分析包括计算固定差异、私有多态位点、共享突变、种群间平均核苷酸差异数、平均核苷酸替代率（Dxy）和净核苷酸替代率（Da）。应用Tajima's D检验评估选择压力并推断种群动态变化。所有分析排除含有空位的位点以确保结果准确性。

2.7. 抗原变异分析

为分析流行野毒株与疫苗株之间的抗原关系，我们从NCBI数据库获得了几种常用疫苗株及其亲本株的序列，包括JXA1（GenBank登录号EF112445.1）及其疫苗株JXA1-P80（FJ548853.1）、CH-1R（EU807840.1）及其疫苗株CH-1a（AY032626.1）、HuN4（EF635006.1）及其疫苗株HuN4-F112、TJ（EU860248.1）及其疫苗株TJM-F92（MN508255.1）、GD（EU825724.1）及其疫苗株GDr180、VR-2332（AY150564.1）及其疫苗衍生株RespPRRS MLV（AF066183.4），以及JA142（AY424271.1）及其疫苗株Ingelvac_ATP（DQ988080.1）。对于商业疫苗株HuN4-F112和GDr180，它们的ORF5基因序列从其全基因组中提取，这些全基因组在本研究中测定。这些序列与67条参考序列及本研究获得的序列一起，使用R进行多维尺度（MDS）分析。使用K80模型计算遗传距离矩阵。前两个MDS维度捕获了总变异的49.6%，有效描绘了不同谱系间的清晰聚类关系。随后进行MDS降维以可视化不同谱系和疫苗株在多维空间中的分布模式和聚类关系，从而能够评估当前疫苗株与流行野毒株之间的抗原匹配度。

2.8. iSNV分析

为检测PRRSV种群内的遗传多样性和准种结构，对全基因组测序数据进行了iSNV分析。清理后的测序读段使用BWA-MEM映射到参考基因组，随后使用SAMtools进行排序和重复标记。基于SAMtools mpileup结果识别变异位点。应用最小覆盖度阈值10x和变异频率阈值1%以最小化测序错误影响。对于每个变异位点，记录包括基因组位置、变异类型、覆盖深度、变异等位基因计数和变异频率等信息，并根据每个变异位置对应的基因区域进行功能注释。

2.9. 重组分析

使用RDP4软件包中实现的七种方法（RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq）检测全基因组序列中的重组事件和断点。当至少五种方法检测到且p值≤0.001时，认为重组事件可靠。使用SimPlot分析（窗口大小：500 bp，步长：20 bp）进行重组区域的视觉验证，并为重组断点两侧区域分别构建系统发育树，通过拓扑变化进一步确认重组事件。重组分析结果用于识别II型PRRSV基因组中的重组热点以及不同谱系间的遗传交换模式。

3. 结果

3.1. 样本采集与PRRSV II型谱系分布

在2024–2025年期间，我们从中国27个省区表现出典型PRRS症状的猪只中收集了328份样本。样本的地理分布显示，广东（n=59，18.0%）、山西（n=33，10.1%）、河南（n=30，9.0%）、湖北（n=29，8.8%）和江苏（n=28，8.5%）是样本数量最多的五个省份，占总样本的54.6%。

系统发育分析显示，中国流行的II型PRRSV可分为五大主要谱系：谱系1.5、谱系1.8、谱系3、谱系5和谱系8.7。为进一步了解这些谱系的时间动态，我们分析了2024年11月至2025年3月的月度PRRSV检测数据。在此期间，共记录了328份阳性样本，其中谱系1.8最为流行（159例，48.5%），谱系3最少（14例，4.0%）。检测在2025年2月达到峰值，共100例，主要由谱系1.8（48例）和谱系1.5（29例）驱动。谱系1（包括谱系1.5和谱系1.8）在全国大多数地区占主导地位，而谱系3、谱系5和谱系8.7分布相对有限。值得注意的是，在广东和山西等省份观察到多谱系共存现象，表明这些地区可能是PRRSV遗传交换的重要场所。系统发育树显示，谱系1.5和谱系1.8形成了相对独立的进化分支，而谱系3毒株表现出高度遗传多样性，在系统发育树上呈现更分散的分布模式。

我们选择了来自谱系1.8、3和8.7的三个代表性毒株进行全基因组测序。这些毒株的选择基于其明显的系统发育位置和流行病学相关性。具体而言，我们的选择标准优先考虑：1）主要且快速传播的谱系（谱系1.8）；2）与商业疫苗密切相关的谱系（谱系8.7）；3）遗传独特且具有区域重要性的谱系（谱系3）。谱系1.8毒株（P24110708wuhan241107）被选为代表快速传播的NADC30-like亚谱系，该亚谱系与中国近期疫情相关。谱系8.7毒株（R24121302heyuan241213）因与疫苗株（如HuN4疫苗、GDR180疫苗和TJM92疫苗）密切的系统发育关系而被选中，这对于理解疫苗相关进化压力至关重要。谱系3毒株（P25012805heyuan250128）与其他ORF5毒株的核苷酸相似性较低（90.9%），并在谱系3内形成一个相对独立的分支，表明它可能代表了一条独特的进化轨迹。这些毒株的全基因组测序平均覆盖深度超过50x，为后续分析提供了可靠的数据基础。

3.2. PRRSV II型传播动态分析

基于Nextstrain的谱系地理分析揭示了在中国流行的各种II型PRRSV谱系间空时传播动态的明显差异。总体而言，谱系1.5和1.8在过去十年中表现出广泛的地理传播，而谱系3和谱系8.7显示出更区域化的传播模式。

具体而言，谱系1.5约2015年起源于黑龙江，随后扩展其范围，主要传播路线向中部和东部省份延伸。到约2025年，该谱系主要分布在河南及周边省份，包括湖北、浙江、山西和河北，反映了其流行病中心随时间的明显转移。相比之下，谱系1.8约2012年首次在中国报道，其传播在2015年至2020年间在广东、河南和四川最为显著。到2025年，传播进一步主要延伸至广东和河南的邻近省份，如湖南、湖北、河北、江苏和陕西，表明从这些关键地区持续向外传播。谱系3显示出独特的地方性传播特征，约2007年起源于广东，并主要局限于南部沿海地区。从2020年到2025年，其传播主要限制在广东、广西和福建，突显了其有限的跨区域传播。此外，谱系8.7在2015年至2025年间主要集中于广东、河南、四川和湖南，广东作为本地和邻近省份传播的主要中心。

总的来说，这些发现证明了谱系间不同的传播轨迹，并强调了区域监测和定制干预策略对于遏制PRRSV在中国传播的重要性。

3.3. PRRSV II型遗传多样性特征

五个主要谱系的ORF5基因序列多样性分析显示，所有谱系均表现出高Hd值（Hd指数；范围0.905至0.993），表明中国流行的PRRSV具有高度遗传变异。大多数谱系在2024年至2025年间保持稳定或略有增加的Hd，而谱系5的Hd值从2024年的0.989下降至2025年的0.905，显示出独特的进化模式。

核苷酸多样性分析揭示了不同谱系间的显著差异。谱系1.8表现出最高的核苷酸多样性（2024年为0.10478，2025年为0.11064），其次是谱系3（2024年为0.09322，2025年为0.09839）和谱系1.5（2024年为0.06343，2025年为0.06548）。相比之下，谱系5和谱系8.7显示出显著较低的核苷酸多样性（分别为0.00620-0.01281和0.02024-0.02128）。值得注意的是，所有谱系在2024年至2025年间均表现出核苷酸多样性增加的趋势，其中谱系5增长最为显著（增加106.6%）。

Tajima's D检验结果显示，所有谱系在不同年份及合并样本中均呈负值，除了2024年的谱系3样本（D=0.53280）。值得注意的是，谱系5（D=?1.93258，p<0.05）和谱系8.7（D=?1.82718，p<0.05）的合并样本达到统计显著性。这些负值表明这些病毒种群可能经历了近期种群扩张或定向选择。

滑动窗口分析进一步揭示了ORF5基因内的变异热点，通常显示5′和3′末端比中间区域变异更高，这与GP5蛋白的结构特征一致。各谱系的变异热点区域在2024年至2025年间保持相对稳定，尽管变异幅度增加，特别是在谱系5中。

3.4. 抗原变异分析

MDS分析结果揭示了不同谱系在抗原空间中的分布模式。结果显示不同谱系形成 distinct 簇群，表明它们可能具有不同的抗原特性。其中，谱系1.5（红色）在多维空间中形成紧密簇群，表明该谱系内具有高抗原同质性。

值得注意的是，谱系5（绿色）和谱系8.7（紫色）在多维空间中与分析疫苗株相对接近，表明现有疫苗株与这两个谱系之间存在潜在抗原相似性。相比之下，谱系3（蓝色）和谱系1.8（橙色）在MDS图上与谱系5和谱系8.7明显分离，暗示它们之间存在显著抗原差异。此外，谱系3毒株在空间中分布相对分散，表明该谱系内可能存在高抗原多样性。

3.5. 重组分析

为研究病毒进化的基因组基础，我们对三个代表性全基因组进行了深入重组分析。该案例研究在所有三个毒株中均揭示了显著且复杂的基因重组事件，突显重组作为关键进化机制的重要性。系统发育分析显示，虽然每个基因组呈现独特的重组模式，但也观察到某些共同特征。

具体而言，所有三个样本均利用HP-PRRSV JXA1作为重组事件的主要亲本株，但每个表现出不同的重组模式和次要亲本株偏好。谱系8.7样本（R24121302heyuan241213）主要采用JXA1作为主要亲本，在11681–13040nt区域检测到与GM2毒株的重组。谱系1.8样本（P24110708wuhan241107）在4645–7420区域与JXA1毒株重组，在12699–14778区域与NADC34毒株重组。

谱系3样本（P25012805heyuan250128）显示出最复杂的重组模式，在多个基因组区域与VR2332和JXA1毒株交替重组。

该案例研究的一个关键观察是ORF2-ORF3区域（约11600–13500nt）似乎是一个潜在重组热点，因为在该区域所有三个 distinct 基因组中均检测到重组事件。值得注意的是，该区域编码参与宿主细胞受体结合和免疫逃避的病毒囊膜糖蛋白。此外，ORF1b区域内的多个片段表现出高重组频率。虽然这些发现基于有限数量的基因组，但此类重组事件的累积效应可能产生具有新抗原特性或增强毒力的重组病毒，挑战当前疫苗的保护效力。

3.6. iSNV分析

为理解II型PRRSV在宿主体内的变异特征，我们对代表两个不同谱系的样本进行了iSNV分析。变异位点分布图显示，谱系8.7样本（R24121302heyuan241213）包含的变异位点（512个）显著多于谱系1.8样本（P24110708wuhan241107，120个）。碱基替换类型分析表明，转换（G?A）在两个谱系中均占主导地位，但具有谱系特异性分布模式。毒株P24110708wuhan241107显示出比毒株R24121302heyuan241213（16.16%）更高比例的T→C转换（31.37%）。

结构蛋白（SP）区域的iSNV分布表现出相似的区域特异性模式。两个样本在GP2、GP4和GP5区域均具有相对较多的变异。相比之下，M蛋白（GP6）和N蛋白（GP7）区域观察到较少变异，表明这些区域可能受到更强的功能约束。基于基因组区域的变异分布显示，在两个毒株中，非结构蛋白区域（NSP）的变异位点数量显著超过SP区域。NSP:SP变异比在谱系8.7样本中为3.4:1（379:111），在谱系1.8样本中为3.9:1（86:22）。

4. 讨论

本次分子流行病学调查揭示了2024–2025年间中国五大主要PRRSV II型谱系（1.5、1.8、3、5和8.7）的共循环现象，其中谱系1.8占主导地位（48.5%）。虽然谱系1.5和1.8显示广泛分布，但谱系3、5和8.7呈现更受限的地理模式。广东和山西等省份表现出多谱系共循环，可能促进遗传交换。我们的分析证实了谱系间显著的遗传多样性、流行毒株与疫苗株间 distinct 抗原关系、广泛的重组（以ORF2-ORF3区域为主要热点）以及谱系特异性的宿主内变异模式。

我们研究中观察到的谱系1.8优势与张等人最近的发现一致，他们记录了NADC30-like毒株（谱系1.8）在中国的快速扩张。他们的研究同样识别出优势流行毒株从经典谱系8.7变种向谱系1.8的转变，将此变化归因于该毒株增强的传播能力和潜在免疫逃避能力。谱系1.8毒株在我们2024–2025年采样中的持续流行表明该谱系通过持续进化和适应保持了其竞争优势。我们的传播动态分析揭示了不同谱系间 distinct 的空时模式，谱系1.5和1.8显示出比更局限于区域的谱系3更广泛的地理传播。这些模式可能反映了病毒适应性、宿主适应以及潜在人为运输因素的差异。类似的异质传播模式由袁等人记录，他们在三年监测研究中识别出某些PRRSV谱系比其他谱系具有更广泛的地理传播能力。谱系3主要局限于中国南部（广东、广西和福建）的受限分布表明可能存在限制其向北部地区传播的生态或其他因素，这一观察值得进一步研究。

所有谱系中观察到的高遗传多样性，特别是在谱系1.8内，表明驱动PRRSV适应的持续进化过程。大多数谱系检测到的负Tajima's D值表明近期种群扩张或纯化选择。谱系1.8中异常高的核苷酸多样性（2025年Pi=0.11064）表明该谱系内存在 substantial 遗传异质性，这可能通过增强对 varying 宿主和环境压力的适应性 contribute 其流行病学成功。有趣的是，谱系5在2024年至2025年间核苷酸多样性的显著增加（106.6%增长）表明该谱系可能正在经历快速的进化变化，需要密切监测。

重组长期被认为是PRRSV进化的主要驱动力，我们的发现与其持续重要性一致。我们在代表性毒株中观察到ORF2-ORF3区域作为重组热点的观察与崔等人先前的发现一致，他们同样识别该区域为频繁重组位点。在我们的谱系3代表性基因组中观察到的复杂重组模式，涉及源自VR2332和JXA1毒株的交替片段，证明了流行PRRSV毒株 intricate 的进化历史。这些重组事件可能 contribute 观察到的遗传多样性，并可能促进对变化选择压力（包括疫苗诱导免疫）的适应。总的来说，我们的重组分析揭示了三个 examined 代表性基因组中的三种 distinct 重组模式。第一种模式，在谱系8.7的代表性基因组中观察到，代表了一个相对简单的重组事件，主要在ORF2-ORF3区域有一个单一交叉点。第二种模式，在谱系1.8的代表性基因组中检测到，展示了一个双重重组 scenario，在ORF1b和ORF2-ORF5区域有 separate 交叉事件。第三种和最复杂的模式，在谱系3的代表性基因组中识别出，呈现整个基因组中多个交替重组事件，创建了源自不同亲本株的镶嵌结构。这些 diverse 重组模式表明不同病毒毒株可能利用 distinct 进化策略，潜在影响病毒适应性和致病性。此外，HP-PRRSV疫苗株JXA1作为所有三个 examined 基因组中的主要亲本株 consistent 参与表明其遗传元件可能为流行病毒提供选择优势；这一发现引起了当前活疫苗田间安全性的担忧，并 warranting 进一步研究这些重组事件的功能后果。

我们的宿主内SNV分析揭示了谱系间病毒种群多样性的 striking 差异，谱系8.7样本比谱系1.8样本携带显著更多的变异位点。我们数据中转换相对于颠换的优势与RNA病毒进化的一般模式一致，而谱系1.8样本中结构变异比例较高可能反映了谱系间不同的进化策略。GP2、GP3和GP5区域相对于更保守的M和N蛋白显著更高的变异突显了作用于不同