共识引导与定向进化协同提升Pedobacter sp. α-L-呋喃糖苷酶热稳定性及2’-岩藻糖基乳糖合成应用研究

本研究通过共识序列引导的理性设计与定向进化技术，成功改造Pedobacter sp.源α-L-呋喃糖苷酶（PbFuc）的热稳定性。筛选获得六处关键突变（G53C/M54I/N59S/T71H/R125C/S199P），构建的组合突变体M6在60°C处理30分钟后仍保留40%活性，最适反应温度提升至40°C。多尺度结构分析表明其稳定性增强源于二级结构构象稳固、三级结构波动减弱、溶剂可及表面积减小及分子相互作用网络（氢键/π-π堆积/电荷补偿）优化，为酶法合成2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL）的工业化应用提供关键酶元件。

　　

Highlight

菌株、载体与化学品

本实验所用菌株大肠杆菌DH5α（E. coli DH5α）与大肠杆菌BL21(DE3)（E. coli BL21(DE3)）为实验室保藏菌种，分别用于基因克隆和蛋白表达。PbFuc的编码基因（Gene ID: ON152707.1）由北京Tsingke Biotech公司合成。pET28a-PbFuc质粒通过BamHⅠ和NotⅠ限制性酶切位点构建目标基因侧翼。大肠杆菌培养采用LB培养基（Luria-Bertani medium）。限制性内切酶BamHⅠ、NotⅠ与DpnⅠ（后续内容因原文截断未完整呈现）

PbFuc定点突变体的构建与筛选

通过多序列比对鉴定出10个进化保守度达70%的氨基酸位点（T71, M115, E176, A278, I333, Y361, Y406, M447, I154, R397）。采用全质粒PCR进行定点突变，成功构建10个单点突变体。1%琼脂糖凝胶电泳验证显示突变体质粒PCR扩增条带符合预期，测序结果证实突变精准引入。如图1A所示（图示说明略），突变体酶活性与热稳定性呈现显著差异性分布。

结论

本研究通过共识引导的酶工程与定向进化策略，显著提升了Pedobacter sp.源α-L-呋喃糖苷酶的热稳定性。M6突变体的多尺度结构修饰产生协同增效机制：二级结构刚性增强赋予抗热变性能力，三级结构疏水核心强化延缓解折叠进程，动态构象优化降低能量扰动，分子相互作用网络重组（包括新氢键形成、π-π堆积增强及静电排斥中和）共同构筑了稳固的热稳定性分子基础。