基于正压微固相萃取(PP-μSPE)的多维肽段分离正交性与吸附剂评价研究

本研究针对复杂肽段混合物在质谱分析中的分离挑战，开发了一种自动化正压微固相萃取(PP-μSPE)平台，系统评价了六种吸附剂（MAX/SCX/HLB/QMA/RP）在离线多维肽段分离中的正交性。通过信息论量化分离性能，发现QMA与低pH RP组合展现最高正交性，成功应用于西妥昔单抗Fab片段分析并获得100%序列覆盖率。该研究为多维蛋白质组学分析提供了可靠的分离策略和方法学基础。

　　

在当今蛋白质组学研究领域，质谱技术的飞速发展使得大规模蛋白质鉴定成为可能，然而复杂生物样品中蛋白质的高动态范围和组成复杂性仍然对分离分析技术提出巨大挑战。特别是基于"自下而上"（bottom-up）策略的蛋白质组学分析中，肽段混合物的高效分离成为制约蛋白质鉴定覆盖率和准确性的关键瓶颈。虽然凝胶电泳等传统分离方法具有一定效果，但色谱分离系统因其灵活的配置、更高的上样容量以及与质谱联用的便利性而逐渐成为主流选择。

多维液相色谱（2D或3D-LC）技术通过组合不同分离机制的色谱维度，显著提升了对复杂肽段混合物的分离能力。然而在线多维色谱系统面临溶剂兼容性的限制，而离线模式虽然提供更好的分离控制，但可能引入样品损失和肽段降解等问题。固相萃取（SPE）技术作为肽段分离、纯化和富集的有效手段，在蛋白质组学工作流程中尚未充分发挥其潜力，特别是在多维分离应用方面。

在这项发表于《Journal of Chromatography Open》的研究中，研究人员开发了一种创新的自动化正压微固相萃取（PP-μSPE）平台，用于离线多维肽段分离。该研究系统评估了六种不同分离机制的吸附剂在肽段分离中的性能，并通过信息论方法量化了各分离方法之间的正交性，为多维蛋白质组学分析提供了重要的方法学基础。

研究采用了几项关键技术方法：使用自动化正压微固相萃取(PP-μSPE)平台进行肽段分馏；通过纳升级超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱(nanoUPLC-ESI-QTOF)进行分析；基于信息论原理计算熵值和互信息来评估分离正交性；以牛血清白蛋白(BSA)胰蛋白酶肽作为模型系统验证方法；最后将优化后的工作流程应用于西妥昔单抗(Cetuximab)Fab片段的序列覆盖分析。

3.1. 肽段分离优化

研究人员优化了六种吸附剂化学性质的1D-μSPE协议，通过调整洗脱缓冲液组成获得了每个方法的六个馏分。结果显示，所有测试方法都产生了可比较的熵值，表明肽段在馏分间分布均衡，其中QMA分馏表现出最高的熵值（2.35比特），表明在基于电荷的分馏中肽段分布最均匀。

3.2. 肽段理化参数对μSPE分馏谱的影响

研究发现肽段长度是影响肽段保留的主要因素，在所有测试的分馏方法中都观察到馏分编号与肽段长度之间存在明显的正相关关系。疏水性和净电荷分别在RPLC和IEX分馏方法中对肽段分布起重要作用，但肽段大小效应导致了显著偏差。

3.3. 1D-μSPE中的肽段分馏效率

通过计算每个分馏方法的熵值来评估1D-μSPE中的肽段分馏效率，QMA分馏表现出最高的熵值，而高pH RP产生的熵值最低。对肽段化学修饰的分析显示，在pH 10条件下总降解修饰数量比pH 2.5条件下增加了约13%，表明高pH条件会诱导肽段不稳定性或聚集。

3.4. 2D-μSPE中分离正交性评估

研究使用信息论方法评估了不同分馏方法对之间的正交性。结果显示，QMA与低pH RP、HLB与QMA、MAX与QMA等组合表现出最高的正交性，这些组合大多将离子交换与基于疏水性的分离模式相结合。相反，低pH RP-高pH RP、MAX-低pH RP等组合表现出较高的相互依赖性。

3.5. 自动化μSPE在优化肽段分馏中的实施

通过西妥昔单抗Fab片段的实际应用证明了自动化PP-μSPE分馏工作流程的实用性。QMA分馏能够识别出先前未检测到的重链肽段，实现了轻链和重链的100%序列覆盖，证明了该方法在复杂治疗性蛋白质分析中的适用性。

3.6. 自动化PP-μSPE的优势与考量

与ZipTips、StageTips或其他负压SPE系统相比，PP-μSPE系统易于自动化且重现性极佳。自动化提供了对流速和体积的精确控制，最大限度地减少了样品损失并确保了馏分间的高度重现性，使得不同样品在定量流程中能够标准化。

该研究通过系统评估六种分馏模式，揭示了肽段理化性质（pI、长度和疏水性）在肽段分布谱中的作用。熵和互信息分析为柱对之间的互补性提供了定量见解。在所有测试方法中，QMA表现出最高的熵值，表明在第一维中具有优异的分离效率。QMA与MAX、低pH RP或HLB的组合实现了最高的累积熵和最低的互信息，表明跨维度正交性增强且肽段谱重叠最小。这些结果强调了组合不同且互补的分离化学对于提高多维工作流程中肽段分辨率和后续蛋白质覆盖度的重要性，或在靶向蛋白质组分析中准确提取肽段的重要性。

PP-μSPE的实际效用通过西妥昔单抗Fab片段的应用得到证明，其中QMA分馏能够识别出先前未检测到的重链肽段，实现了完整的序列覆盖，突显了该工作流程在复杂治疗性蛋白质分析中的适用性。此外，观察到的肽段保留与理化性质之间的系统相关性支持预测建模，以简化方法开发并优化多维2D-μSPE工作流程中的馏分选择。