开放培养链 elongation (CE) 中生物膜系统提升己酸生产力的比较研究：机制、性能与微生物群落分析

本研究针对微生物链 elongation (CE) 技术合成中链脂肪酸 (MCFAs) 过程中体积生产力不足的问题，比较了两种商用载体 (AnoxK? Z-200 和 K5) 构建的生物膜系统与浮游系统的性能。结果表明，生物膜系统（尤其是 K5）显著提高了己酸的生产力（达 8.1 ± 0.8 g/L/d），并展现出更短的滞后期和更快的反应动力学。通过显微可视化、EPS 分析和微生物群落测序，研究证实生物膜通过提高功能微生物丰度、增强生物质浓度和促进胞外聚合物 (EPS) 分泌来优化 CE 性能，为推进 CE 技术在可持续化学制造和脱碳中的应用提供了重要依据。

　　

在全球能源消耗持续增长和气候变化日益严峻的背景下，利用生物技术将废弃物转化为高附加值化学品已成为实现可持续发展的关键路径之一。微生物链 elongation (CE，链延长) 技术尤其展现出巨大潜力，它能够利用含有简单短链化学构建块（如乙酸和乙醇）的废物流，生产有价值的中链脂肪酸 (MCFAs，通常指含有 6 至 12 个碳单元的羧酸)。这些 MCFAs 在能源和化学工业中具有广泛的应用前景，有望替代依赖化石碳源的传统化工生产，从而助力全球脱碳进程。然而，CE 技术要实现商业化应用，其经济可行性受到一个关键参数的制约——体积生产力。低生产力意味着需要更大的反应器规模和更高的资本支出，这使得过程成本高昂。此外，在传统的悬浮（浮游）系统中，功能微生物生长缓慢、易受产物（如 MCFAs）及其他抑制剂（如氨和氧气）毒性的影响，导致系统稳定性差、微生物活性低，进一步限制了生产力的提升。

为了解决上述问题，研究人员将目光投向了生物膜系统。生物膜是微生物聚集并附着在载体表面形成的结构化群落，其外部由胞外聚合物 (EPS) 构成的基质包裹。这种结构赋予生物膜系统许多悬浮系统无法比拟的优势：更好的生物质保留能力、更高的稳定性以及对有毒或抑制物质的更强抵抗力。先前的一些研究尝试使用小麦秸秆、生物炭等多孔材料作为载体来提升 CE 性能，并观察到积极效果。然而，这些天然材料本身可能通过吸附毒素或促进微生物间直接电子传递等其他机制来促进 CE 过程，使得“生物膜形成”本身的贡献难以被单独评估。因此，迫切需要利用惰性载体来专门研究生物膜在 CE 系统中的作用、贡献及其背后的强化机制。

为此，来自澳大利亚昆士兰大学水与环境生物技术中心的研究团队在《Journal of Environmental Management》上发表了一项研究。他们开展了一项对比研究，旨在阐明生物膜系统如何增强开放培养中乙酸和乙醇向己酸（一种 MCFA）的转化。研究团队设置了三个反应器：两个分别填充了商业化的惰性载体 AnoxK? Z-200 和 K5 以形成生物膜系统，另一个则不添加载体作为浮游（悬浮）对照系统。研究通过逐步缩短反应时间（从 8 天最终至 0.5 天）的运行策略来富集生物膜并测试其在不同操作条件下的性能。他们系统地比较了各系统的底物消耗、产物生成、体积生产力以及反应动力学。为了证实生物膜的形成并探究其功能，研究人员综合运用了扫描电子显微镜 (SEM) 和共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 进行形态学观察，量化了生物膜中的胞外聚合物 (EPS) 组分（包括多糖 PS、蛋白质 PN 和腐殖酸 HA），并通过 16S rRNA 基因测序分析了微生物群落的组成和变化。

本研究主要采用了以下几种关键技术方法：1）使用填充有商用惰性载体（AnoxK? Z-200 和 K5）的批次反应器系统进行长期（283天）的链 elongation 培养，通过逐步缩短反应时间（8天至12小时）的策略富集和测试生物膜性能；2）利用气相色谱 (GC) 技术对短链脂肪酸 (SCFAs)、中链脂肪酸 (MCFAs) 及醇类等代谢产物进行精确定量分析；3）通过扫描电子显微镜 (SEM) 和共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 对载体表面形成的生物膜进行形态学观察和可视化验证；4）采用化学提取（热法）结合改良Lowry法和蒽酮法分别对生物膜胞外聚合物 (EPS) 中的蛋白质 (PN)、多糖 (PS) 和腐殖酸 (HA) 进行组分定量；5）基于 16S rRNA 基因测序技术对从初始接种物和各系统液相/生物膜相样品中提取的DNA进行微生物群落结构分析。研究所用接种物源自实验室一个已具备链 elongation 功能的母反应器。

3.1. 反应时间对链 elongation 性能的影响

通过比较不同反应时间下各系统的性能，研究发现，在较长的反应时间（8天和4天）下，三个系统的性能相似。但当反应时间缩短至12小时时，性能出现显著分化。生物膜系统，尤其是K5系统，能够维持更高的底物利用效率和产物生成量。例如，在12小时反应时，K5系统消耗了148 ± 12 mM乙醇和57 ± 4 mM乙酸，生成了44.8 ± 0.4 mM丁酸和35 ± 3 mM己酸，其底物利用效率高达61.9%，分别是Z-200系统和浮游系统的1.6倍和4.0倍。这表明在短循环时间下，生物膜系统能更好地保留微生物并维持其活性。

3.1.2. 体积生产力

体积生产力是评估生物生产过程可行性的关键指标。结果表明，生物膜系统的生产力显著高于浮游系统。丁酸的生产力在Z-200和K5系统中随着反应时间缩短而逐渐增加（最高分别达7.2 ± 0.1 g/L/d 和 7.90 ± 0.07 g/L/d）。对于己酸，K5系统的生产力持续攀升，在12小时反应时达到最高值8.1 ± 0.8 g/L/d，而浮游系统的最高生产力仅为3.0 ± 0.1 g/L/d（在2天时）。此外，K5系统在短反应时间下还能维持更高的己酸/丁酸比率，表明其拥有更高的微生物活性，能更有效地将代谢流向目标产物己酸推动。

3.2. 链 elongation 反应过程中底物利用和产物生成的动态变化

通过48小时的周期研究并采用修正的Gompertz模型进行动力学拟合，研究发现生物膜系统，尤其是K5，表现出更快的反应速率和更短的滞后期。K5系统对乙酸和乙醇的最高消耗速率分别为3.2 mM/h和7.1 mM/h，是浮游系统的2倍和1.5倍。相应地，其丁酸和己酸的生成速率也最高（分别为4.1 mM/h和2.5 mM/h）。碳平衡计算表明，消耗的底物几乎全部转化为了酸和丁酸，没有检测到甲烷生成，表明碳流成功地导向了链 elongation 反应，竞争性反应（如产甲烷）可忽略不计。

3.3. 生物膜的形成

3.3.1. 生物膜化学组分分析

对生物膜关键组分EPS的分析显示，K5系统的总EPS含量最高（L-EPS: 90 ± 5 mg/g Protein; T-EPS: 187 ± 9 mg/g Protein），其次是Z-200系统，浮游系统最低。蛋白质 (PN) 和多糖 (PS) 是EPS的主要组分。特别地，K5系统拥有最高的PN/PS比率（>20），约是Z-200和浮游系统的2倍。高的PN含量和PN/PS比率通常与更强的细胞附着能力和更稳定的生物膜结构相关，这可能是K5系统性能更优的原因之一。

3.3.2. 各系统中生物量的比较

生物量化结果显示，生物膜系统中的大部分生物质附着在载体上。Z-200和K5载体上的蛋白质含量分别为71 ± 3 mg和108 ± 4 mg，而其液相中的蛋白质含量仅为12 ± 3 mg和10.1 ± 0.5 mg。相比之下，浮游系统的总生物量（33 ± 2 mg蛋白质）仅占K5系统的28.2%。这表明生物膜系统成功实现了生物质的高效保留，这是其在高稀释率（短HRT）下仍能保持高性能的关键。

3.3.3. 生物膜成像

SEM和CLSM图像直观地证实了生物膜在Z-200和K5载体上的成功形成。图像显示载体表面被杆状微生物（尺寸1-4.5 μm）覆盖，这些微生物聚集在一起并被疑似EPS的聚合物物质所包裹。K5载体上观察到更多的微生物附着和EPS，与化学分析结果一致。CLSM图像显示载体表面覆盖着活细胞和/或死细胞，进一步证实了生物膜的存在。

3.4. 微生物群落分析

通过对初始接种物、各系统液相和生物膜样品的16S rRNA测序分析，研究发现所有系统都富集了主要的链 elongation 功能微生物——Clostridium sensu stricto 12（相对丰度17.3%–25.6%）。与浮游系统相比，生物膜系统特异性富集了更多已知与链 elongation 相关的菌属，包括Bacteroides、Lachnoclostridium、Caproiciproducens 和 Proteiniphilum。例如，Lachnoclostridium 在生物膜样品中的丰度（Z-200: 5.0%; K5: 4.1%）高于液相样品（1.3%–2.4%）。K5生物膜样品中Proteiniphilum的丰度高达14.4%，这可能与其EPS中高PN组分有关。Alpha和Beta多样性分析表明，K5生物膜形成了一个独特且与其他样品显著不同的微生物群落，这可能是其性能增强的重要原因。值得注意的是，在所有样品中均未检测到产甲烷古菌，这与实验过程中未检测到甲烷的结果一致，归因于接种物本身缺乏产甲烷菌以及批次操作模式造成的短微生物停留时间。

本研究得出结论，利用商用惰性载体构建的生物膜系统能显著增强开放培养链 elongation (CE) 过程生产己酸的性能。生物膜的形成通过三大机制发挥作用：提高了系统内的生物质浓度和滞留能力；富集了包括Clostridium sensu stricto 12、Bacteroides、Lachnoclostridium、Caproiciproducens 和 Proteiniphilum在内的多种功能微生物；促进了胞外聚合物 (EPS) 的分泌，尤其是蛋白质 (PN) 组分，从而增强了微生物的附着和生物膜结构的稳定性。这些因素共同导致了更短的反应滞后期、更快的反应动力学以及最终更高的体积生产力（K5系统达8.1 ± 0.8 g caproate/L/d）。该研究不仅证实了生物膜系统在提升CE性能方面的优势，更重要的是深入揭示了其背后的微生物学机制，为设计和优化基于生物膜的CE生物工艺提供了坚实的理论依据和实践指导。推动CE技术向更高效率、更稳定、更经济的方向发展，对于实现废弃物资源化、化学品可持续制造和全球脱碳目标具有重要意义。