协同酪蛋白去除与膜浓缩策略实现牛奶细胞外囊泡的高纯度可规模化分离：从工艺优化到功能验证

本研究针对牛奶细胞外囊泡(mEVs)分离中存在的低丰度与酪蛋白干扰难题，系统比较了酶沉淀(EP)与酸沉淀(AP)两种前处理方法，并结合膜浓缩(MC)、真空加热浓缩(VHC)和真空冷冻浓缩(VFC)三种技术，开发出EP-MC-超速离心(UC)联用新工艺。该方案成功获得形态完整、纯度更高的mEVs，其RNA保留率与抗炎活性显著优于传统方法，为mEVs的大规模生产与功能应用提供了关键技术支撑。

　　

牛奶被誉为自然界中最具营养价值的食品之一，不仅富含必需营养素，近年来其含有的细胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）因具有调控机体健康的功能而备受关注。这些由脂质双层包裹的纳米颗粒（30-1000 nm）携带功能性生物分子（如mRNA、microRNA和lncRNA），能够通过细胞间通讯机制直接调节受体细胞生理功能，在疾病诊断和药物递送领域展现出巨大应用潜力。然而，牛奶中EVs的低浓度特性与酪蛋白胶束的尺寸干扰，使得大规模高效分离高纯度牛奶源性细胞外囊泡（milk-derived extracellular vesicles, mEVs）成为行业技术瓶颈。

传统超速离心（ultracentrifugation, UC）虽为EVs分离的"金标准"，但面对牛奶复杂基质时存在两大挑战：一是酪蛋白-磷酸钙胶束与mEVs的尺寸重叠造成离心干扰；二是仪器处理容量限制（<100 mL/次）难以满足工业化需求。目前常用的酸沉淀（acid precipitation, AP）法虽可去除酪蛋白，但会导致蛋白变性，而真空加热浓缩（vacuum heating concentration, VHC）过程可能引起热敏成分降解。因此，开发既能保持mEVs生物活性又具备规模化应用前景的分离技术迫在眉睫。

针对这一难题，西北农林科技大学食品科学与工程学院叶玉亭、葛俊霖等研究人员在《Journal of Future Foods》上发表论文，系统比较了酶沉淀（enzyme precipitation, EP）与酸沉淀两种前处理方法，并结合三种浓缩技术（膜浓缩membrane concentration, MC、VHC和真空冷冻浓缩vacuum freeze concentration, VFC），建立了一套高效、可规模化的mEVs分离工艺。

研究采用多维度技术验证体系：通过纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）测定粒径分布，透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察形态特征，蛋白质印迹（western blotting, WB）检测标志蛋白（CD63、CD81、TSG101、Alix和Calnexin），并利用RAW264.7巨噬细胞模型评估mEVs的增殖活性与抗炎功能。实验样本涵盖生鲜牛奶、巴氏杀菌奶（PM）和超高温处理奶（UHTM）等多种乳源。

3.1. mEVs的分离与表征

通过系统优化分离流程（图1），研究发现EP处理后经MC浓缩获得的mEVs得率最高，沉淀透明度最佳。WB检测证实所有组均表达EV特异性标志蛋白CD81和TSG101，TEM显示典型的杯状脂质双层结构，NTA分析表明粒径符合ISEV标准（100-300 nm）。

3.2. 粒径与浓度比较

EP组mEVs浓度显著高于AP组（1.7-2.3倍），其中MC-EP组浓度最高（4.73×10¹²±2.13×10¹⁰ particles/mL）。MC组粒径分布最均匀（<1%多分散性），而VHC和VFC组出现5-6%非标准颗粒。EP-MC组合被确定为最优策略。

3.3. 形态学特征

TEM揭示关键差异：AP组mEVs形态不规则且背景不均匀；VHC组出现膜解体现象；VFC组呈椭圆形且尺寸分散；而MC组保持球形单分散性，脂质双层完整。这些发现证实EP-MC能最佳保持mEVs结构完整性。

3.4. 标志蛋白分析

WB结果显示：EP处理后MC、VFC和VHC组均检测到三种阳性蛋白（CD63、TSG101和Alix）显著信号，但VHC组CD63和Alix信号较弱。值得注意的是，VHC和VFC组出现阴性蛋白Calnexin信号，表明存在内质网污染，而MC组无此现象。AP组蛋白信号整体低于EP组，证明EP法更能保持蛋白完整性。

3.5. RNA含量分析

MC组RNA浓度显著高于VFC和VHC组（p<0.05），且纯度最佳（OD_260/280=1.97±0.07）。VHC和VFC组出现异常比值（2.17-2.29），提示存在蛋白/有机污染。真空辅助热 processing导致约75%RNA损失，与TEM观察到的膜破坏现象相关。

3.6. 体外功能比较

CCK-8实验表明MC制备的mEVs具有最强增殖促进效果（p<0.05）。在LPS诱导的炎症模型中，MC组mEVs对促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）的抑制效果显著优于VHC和VFC组，证明MC技术能更好保留mEVs的生物活性。

3.7. 不同乳源EVs分离结果

将EP-MC方案扩展至山羊奶和商业乳制品（PM和UHTM），发现UHTM中EV标志蛋白信号显著减弱，TEM几乎未检测到完整囊泡，证实热加工会破坏EV结构完整性。而生山羊奶中MC预处理成功保留了EV生物标志物和形态特征，证明该方法具有跨物种适用性。

研究结论表明，EP结合MC的策略在mEVs分离效率、形态完整性、标志蛋白表达和RNA保留方面均表现优异，克服了AP法的蛋白污染、VHC法的热降解和VFC法的高成本限制。这种EP-MC-UC三联方案为工业级mEVs生产建立了可扩展框架，其跨乳源兼容性凸显了大规模生物加工的适用性。

该研究的重大意义在于：首次系统比较了多种前处理与浓缩技术的组合效应，建立了兼顾产量与活性的优化方案；证实膜浓缩技术在保持mEVs结构功能完整性方面的独特优势；为mEVs在功能食品开发和精准营养领域的应用提供了关键技术支撑。通过桥接实验室技术与工业需求，该研究为解锁mEVs在生物医学和营养健康领域的全部潜力提供了转型框架。