利用γ修饰肽核酸（PNA）介导的基因编辑技术靶向HBB基因：β-地中海贫血基因治疗新策略

本研究针对单基因遗传病基因编辑效率低和安全性问题，开发了基于γ修饰肽核酸（PNA）与供体DNA共载的PLGA纳米颗粒基因编辑体系。通过体外细胞实验成功实现HBB基因IVS I-6位点特异性突变引入，获得3.7%的编辑效率并证实编辑效果的持续性，为β-地中海贫血等单基因病的治疗提供了新方案。

　　

在遗传性疾病治疗领域，基因编辑技术正带来革命性突破。β-地中海贫血作为最常见的单基因遗传病之一，在全球范围内影响数百万人，其中IVS I-6（T>C）突变是埃及人群中最常见的热点突变。尽管CRISPR/Cas9等基因编辑工具发展迅猛，但仍面临脱靶效应、免疫原性和递送效率等多重挑战。肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）作为一种人工合成的核酸类似物，以其独特的聚酰胺骨架结构展现出卓越的核酸结合能力和生物稳定性，成为基因编辑领域的新兴工具。

埃及国家研究中心人类遗传与基因组计划研究所的Noha Eltaweel团队在《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》发表的研究，开创性地建立了基于γ修饰PNA（gamma modified PNA）的基因编辑技术平台。研究人员选择HBB基因作为模型，通过精心设计的PNA/供体DNA系统，成功在正常人皮肤成纤维细胞中引入β-地中海贫血相关的IVS I-6突变，为后续逆转突变策略奠定了方法学基础。

研究采用的主要技术方法包括：1）从健康埃及志愿者获取皮肤活检样本进行原代成纤维细胞培养；2）设计特异性靶向HBB基因的γ修饰PNA和含IVS I-6突变的供体DNA；3）利用双乳液溶剂蒸发法制备PNA/DNA共载的PLGA纳米颗粒；4）通过凝胶迁移实验（EMSA）、透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）对纳米颗粒进行表征；5）采用等位基因特异性定量PCR（AS-qPCR）和测序分析编辑效率。

3.1. Structure of PNA and donor DNA

研究人员设计了特异性靶向HBB基因551-600区域的50nt供体DNA，其中心区域跨越外显子1和内含子1交界处，并在两端引入三个硫代磷酸酯键（phosphorothioate internucleoside linkage）以增强核酸酶抗性。同时设计了26碱基的γPNA，在WC链每3个碱基进行miniPEG-γ修饰，包含13个碱基的Watson-Crick结构域和13个碱基的Hoogsteen结构域，中间通过8-amino-2,6,10-trioxaoctanoic acid linker连接。

3.2. PNA mobility shift assay results

凝胶迁移实验显示PNA与靶PCR产物结合后出现明显上移条带，证实了PNA与目标DNA序列的特异性结合能力，为后续基因编辑实验提供了有效性验证。

3.3. NPs formulation and characterization

通过双乳液溶剂蒸发法制备的PLGA纳米颗粒呈现白色棉絮状多孔结构。负载测试显示每毫克纳米颗粒含有455pmol供体DNA和970pmol PNA，封装效率达93.77%。TEM显示颗粒呈球形，尺寸约500nm；DLS分析显示空白纳米颗粒尺寸109nm，负载纳米颗粒尺寸153nm，多分散指数（PdI）小于0.2，表明颗粒分布均匀。Zeta电位测量显示负载纳米颗粒表面电荷为5mV，有利于细胞摄取。

3.4. Fibroblast adhesion to the plate and cell Treatment

显微镜观察显示PLGA纳米颗粒处理不影响成纤维细胞的贴壁和形态，细胞保持典型的纺锤形形态，表明纳米颗粒具有良好的生物相容性。

3.5. Pre- and post-treatment molecular analyses

测序分析证实初始样本（DNA-0）为野生型纯合子（T/T），而处理后样本（DNA-1）成功引入IVS I-6突变（T>C）。AS-qPCR定量分析显示，第一次剂量后突变等位基因频率达到3.7%，第二次剂量后为2.65%，与初始样本相比均有显著差异（p值分别为0.015和0.043）。熔解曲线分析证实了AS-PCR的特异性。

3.6. Total RNA extraction and measuring the expression of the HBB gene

qRT-PCR分析显示HBB基因表达在第一次剂量后下降至约50%，这种表达改变在移除纳米颗粒后仍然持续，表明编辑效果对基因功能产生了实质性影响。

3.7. Persistence of gene editing

移除纳米颗粒培养一周后，DNA-1*样本的编辑频率（2.75%）与DNA-1样本无显著差异，证实基因编辑效果的持久性，不依赖于纳米颗粒的持续存在。

研究结论表明，γ修饰PNA介导的基因编辑技术能够以较高效率（3.7%）和特异性引入HBB基因突变，编辑效果具有持久性。该方法成功建立了PNA基因编辑技术平台，封装效率高达93.77%的PLGA纳米颗粒提供了有效的递送系统。特别值得注意的是，该研究是非洲地区首次建立PNA基因编辑技术，为β-地中海贫血等单基因遗传病的治疗提供了新的技术路径。研究人员强调，这种方法的低炎症反应特性和高特异性使其在临床转化方面具有显著优势，未来可通过逆转策略应用于β-地中海贫血突变的具体校正，为遗传病基因治疗开辟了新方向。