利用多光子荧光寿命成像技术解析基因编码血红素传感器的动态监测机制及其在深部组织成像中的应用前景

本文系统介绍了多光子荧光寿命成像技术（MP-FLIM）在基因编码血红素传感器研究中的突破性应用，通过共振能量转移（RET）机制实现对细胞血红素分布的精准量化，为深部组织成像和活细胞动态监测提供了低光毒性、高穿透性的创新解决方案。

　　

Protein expression and purification

蛋白质表达与纯化

纯化的脱辅基mEGFPmAPX和mEGFP参照文献[5]所述流程制备。简言之，将大豆抗坏血酸过氧化物酶通过点突变（K14D与E112K）获得单体变体，以重组方式表达为与单体增强绿色荧光蛋白（mEGFP；F64L/S65T/A206K）的融合蛋白，载体为pLEICS-45（携带氨苄抗性及N端组氨酸标签）。另单独表达单体增强绿色荧光蛋白（mEGFP；F64L/S65T/A206K）。

Single-photon vs. multi-photon excitation of protein chimeras for measuring the abundance of exchangeable heme

单光子与多光子激发蛋白嵌合体技术对比：可交换血红素定量研究

血红素与mAPX结合后在406 nm处产生索雷特带（Soret band），500 nm以上出现Q带（图2A棕色线）。mEGFP发射带与全息mAPX的Q带光谱重叠（图2A），导致当mEGFP紧邻血红素分子时发生共振能量转移（RET），荧光蛋白发射被部分淬灭（见图2B全息mAPXmEGFP）。图2A的光谱重叠积分值为1.2×10^?30。

Conclusion

结论

我们证实多光子荧光寿命成像显微镜（MP-FLIM）可用于探测血红素的细胞分布，其结果与既往单光子激发传感器在HEK293细胞中的研究高度一致。多光子成像采用的近红外波长因散射减少而具备更优的组织穿透能力，未来有望将血红素定量研究拓展至活体动物及昆虫模型的深部组织成像领域。