低能X射线联合柠檬酸协同灭活不锈钢表面食源性病原菌生物膜的作用机制与效能研究

本研究针对食品加工中不锈钢表面常见食源性病原菌生物膜难以彻底清除的问题，探讨了低能X射线(0.1-0.5 kGy)与0.1%柠檬酸(CA)联合处理的协同杀菌效应。结果表明：联合处理使大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌生物膜细胞分别减少5.10、4.31和3.96 log CFU/coupon，并显著降低胞外聚合物(EPS)中多糖含量和生物膜形成相关基因表达。该研究为食品接触面消毒提供了新型非热力杀菌策略。

　　

在食品工业领域，不锈钢表面形成的病原菌生物膜一直是食品安全的重要隐患。大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌等食源性病原菌能在设备表面形成具有保护性的生物膜结构，其分泌的胞外聚合物(Extracellular Polymeric Substances, EPS)基质能有效抵抗传统消毒方式，导致常规清洗消毒效果有限。这些顽固存在的生物膜成为食品加工过程中交叉污染的重要源头，可能引发严重的食源性疾病暴发。目前常用的物理化学去污方法往往难以穿透生物膜基质，迫切需要开发新型高效的非热力杀菌技术。

为解决这一行业难题，首尔国立大学农业与生命科学研究所的研究团队创新性地将低能X射线辐照与天然有机酸结合，开展了系统性的协同杀菌机制研究。该研究成果近期发表在食品科学与技术领域权威期刊《LWT-Food Science and Technology》上，为食品加工环境的生物膜控制提供了重要技术支撑。

研究人员采用的主要技术方法包括：使用标准菌株ATCC系列构建多菌种生物膜模型；通过X-Rad 160 XL系统进行精确剂量X射线辐照(0.1-0.5 kGy)；采用荧光染色法(Calcofluor White和FITC)定量分析EPS中多糖和蛋白质含量；使用SPINeasy DNA Kit提取并定量胞外DNA(eDNA)；通过CellTiter-Glo? 2.0试剂盒测定ATP活性评估细胞存活状态；应用qRT-PCR技术检测生物膜形成相关基因(bcsA、flhD、luxS)的表达变化。

3.1. X射线-CA联合处理对STS 2B上生物膜的灭活效果

研究结果显示，单独使用0.5 kGy X射线可使三种病原菌生物膜活菌数减少1.65-1.83 log CFU/coupon，而单独使用0.1% CA处理20分钟仅能减少0.93-1.76 log CFU/coupon。令人瞩目的是，两者联合处理产生了显著的协同效应：对大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌的生物膜细胞分别实现了5.10、4.31和3.96 log CFU/coupon的减少量，协同增效达到1.35-1.57 log单位。即使在较低剂量(0.1 kGy)下，联合处理也表现出显著优于单独处理的杀菌效果。

3.2. 损伤细胞的复苏

通过液体修复方法评估损伤细胞的复苏情况，发现经X射线-CA联合处理后，三种病原菌的损伤细胞均未出现显著复苏现象(P > 0.05)。这表明联合处理不仅能够有效杀灭生物膜细胞，还能造成不可逆的细胞损伤，从根本上避免了病原菌的再生风险。

3.3. 生物膜EPS中多糖、蛋白质和胞外DNA(eDNA)含量的减少

对生物膜基质关键组分的定量分析揭示了联合处理的独特作用机制。Calcofluor White染色结果显示，X射线-CA联合处理使三种病原菌生物膜中多糖的释放量显著高于单独处理的总和(P < 0.05)。特别是对鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌，联合处理导致的多糖释放量分别是单独X射线处理的3倍和4倍。蛋白质和eDNA的定量结果同样表明，联合处理能更有效地破坏生物膜的三维结构：处理组中蛋白质和eDNA的释放量均遵循CA < X射线 < X射线-CA的递增顺序。

3.4. 病原菌生物膜中ATP水平的定量

细胞内ATP水平的检测为评估细胞存活状态提供了重要依据。X射线单独处理使三种病原菌的发光强度降低2.8-5.0倍，而CA单独处理的效果相对较弱。与之形成鲜明对比的是，X射线-CA联合处理导致了更为显著的ATP水平下降：大肠杆菌O157:H7、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌分别降低了19.8倍、24.5倍和43.6倍。这一结果与菌落计数结果高度一致，证实了联合处理对生物膜细胞的彻底灭活效果。

3.5. X射线-CA联合处理后生物膜相关基因的转录变化

基因表达分析揭示了联合处理在分子水平上的作用机制。以recA为内参基因，qRT-PCR结果显示，单独X射线处理下bcsA、flhD和luxS基因的相对表达水平分别为0.6、0.81和0.69，单独CA处理下flhD和luxS的表达水平为0.83和0.68。而X射线-CA联合处理则显著下调了这些生物膜形成关键基因的表达：bcsA(纤维素合成基因)、flhD(鞭毛合成调控基因)和luxS(群体感应主要调控基因)的表达水平分别降至0.17、0.4和0.37。这种协同性的基因表达抑制效应从分子层面解释了联合处理抑制生物膜形成的机制。

研究结论与讨论部分强调，X射线-CA联合处理通过多种互补机制实现了协同杀菌效应：一方面，X射线辐照产生的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)能够氧化降解EPS中的多糖链、变性蛋白质和片段化eDNA；另一方面，CA通过降低细胞内pH值、螯合必需金属离子和破坏细胞膜电位等方式削弱细菌的防御系统。这两种作用的结合不仅物理破坏了生物膜结构，还从遗传水平抑制了生物膜形成相关基因的表达。

该研究的重要意义在于首次系统论证了低能X射线与柠檬酸联合处理对不锈钢表面多种食源性病原菌生物膜的协同清除效果，并深入阐明了其作用机制。相比传统的氯系消毒剂，这种组合策略具有无化学残留、环境友好、对设备腐蚀性小等优势，特别适合食品加工设备的在线清洗消毒。研究结果为解决食品工业中的生物膜污染问题提供了创新性的技术方案，为开发新型非热力杀菌工艺奠定了理论基础。

未来的研究可进一步优化处理参数，拓展到其他食品接触材料，并评估该技术对食品品质的影响，以推动其在实际生产中的应用。同时，通过转录组学和蛋白质组学等高通量技术深入解析联合处理的分子机制，将有助于发现更多生物膜控制的新靶点。