酿酒酵母冻干过程中胞内代谢物变化规律及靶向补充策略提升存活率的研究

本研究针对酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在干燥保存过程中代谢稳定性易受损的问题，通过LC-MS/MS代谢组学技术系统比较了冷冻干燥（FD）、流化床干燥（FBD）和微胶囊化（Enp）三种干燥方式对酵母胞内外代谢谱的影响。研究发现FD显著改变胞内氨基酸（如脯氨酸和谷氨酸）水平，而外源补充这两种代谢物可使酵母存活率分别提高5.71倍和3.04倍，为无冷冻保护剂的工业酵母保存提供了新策略。

　　

在食品工业、生物技术和益生菌制剂等领域，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作为一种重要的工业微生物，其高活性和代谢稳定性的保持一直是研究的重点。干燥处理能够显著延长酵母的保存时间并便于运输，因而成为工业规模微生物保存的主要手段。目前常用的干燥技术包括冷冻干燥（freeze-drying, FD）、流化床干燥（fluidized bed drying, FBD）和微胶囊封装（encapsulation, Enp）等。然而，这些干燥过程可能对细胞造成不可逆损伤，导致存活率下降、功能丢失或代谢特性改变，进而影响酵母在发酵过程中的性能。尽管已有研究从生长速率、酒精产率等表型层面评估干燥的影响，但干燥对酵母代谢层面——尤其是胞内代谢物组成的影响仍缺乏系统研究。代谢组的微小变化很可能是细胞应激或退化的早期标志，因此从代谢物角度评估干燥技术的优劣，对工业菌株的长期稳定性具有重要意义。

为系统评估不同干燥方式对酿酒酵母代谢状态的影响，韩国食品研究院传统食品研究组的Eunjung Lee和Jang-Eun Lee开展了一项基于高分辨率液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的代谢组学研究，成果发表在《LWT》。该研究以从传统酒曲中分离的S. cerevisiae KFCC11964P为材料，系统比较了FD、FBD和Enp三种干燥方式处理前后酵母胞内与胞外代谢物的变化，并进一步探讨了关键代谢物补充对提升细胞存活率的作用。

研究采用了基于LC-Orbitrap MS/MS的高分辨率代谢组学分析技术，结合多元统计方法（包括PCA、PLS-DA和OPLS-DA）进行数据挖掘。酵母样本在YM培养基中培养后经三种不同干燥方式处理，胞内与胞外代谢物分别通过冷乙腈提取和真空浓缩制备，质谱数据采用Compound Discoverer 3.3和SIMCA-P+ 17.0进行处理和建模。细胞存活率使用LUNA-II YF?自动酵母计数仪测定，并采用荧光活/死染色验证。统计分析使用GraphPad Prism完成，组间比较采用t检验或ANOVA。

研究首先通过非监督的主成分分析（PCA）和监督的偏最小二乘判别分析（PLS-DA）对三种干燥方式下的胞外代谢物进行比较，结果显示不同干燥处理并未引起胞外代谢谱的显著改变。与之相反，在胞内代谢物分析中，FD处理组呈现出明显的分离趋势，模型参数（R2X = 0.775–0.799，Q2 = 0.978–0.991）表明FD引起胞内代谢组的显著扰动。

通过变量重要性投影（VIP>3.9）和t检验筛选出29个受到FD显著影响的代谢物，包括脯氨酸（L-(+)-Proline）、谷氨酸（DL-Glutamic acid）、丝氨酸、麦芽糖和葡萄糖等。其中，脯氨酸和谷氨酸在FD组中含量显著降低，提示它们可能在冻干过程中被大量消耗或泄漏。

基于上述发现，研究人员在酵母培养阶段添加0.5%的脯氨酸或谷氨酸，结果显著提高了FD后的细胞存活率——脯氨酸组提高5.71倍，谷氨酸组提高3.04倍（p<0.001）。活死染色进一步证实了这两种氨基酸对细胞的保护效果。

实验结果表明，不同于FBD和Enp，FD虽然保持了较高的细胞存活数量（>9 log CFU/g），却显著改变了酵母胞内代谢物的组成，尤其是一些关键氨基酸和糖类。外源性补充脯氨酸和谷氨酸能够有效逆转这一趋势，显著提升酵母的抗冻干能力。这一发现不仅揭示了氨基酸在细胞干燥保护中的重要作用，也为无需添加传统冷冻保护剂（如甘油或海藻糖）的酵母保存策略提供了新思路。

该研究的深刻意义在于将微生物代谢组学成功应用于工业菌株保存评估中，从代谢物层面揭示了干燥应激的潜在机制，并提出了以代谢物补充为导向的细胞保护策略。这一方法具有良好的应用前景，可用于其他重要工业微生物如乳酸菌、芽孢杆菌的保存工艺优化，对食品发酵、益生菌制剂及生物制造过程中菌株性能的稳定性和一致性具有重要推动意义。