利用半理性设计策略改造的磷脂酶D突变体（其转磷脂酰化活性得到增强），实现磷脂酰甘油的高效合成

《LWT》：Efficient synthesis of phosphatidylglycerol using phospholipase D mutant with enhanced transphosphatidyl activity modified by the semi-rational design strategy

磷脂酶D（PLD）突变体G381A通过定向进化策略显著提升磷脂酰甘油（PG）合成效率至97.6%，较野生型提高36%。结构分析显示G381A的379-385环重构增大催化口袋体积（447→549 ?3），消除W187的范德华相互作用，增强底物结合能力。动力学参数表明突变体Km降低7.4%，Vmax提升1.5倍，酶活性达35.7 U/mL（摇瓶）和0.84 U/mL（发酵罐）。优化条件包括32°C、pH8.0、醚/水相比1:2.5、甘油/PC摩尔比160:1。该研究为PLD定向进化及规模化PG制备提供新范式。

　　磷脂酶D（Phospholipase D, PLD）是一种具有高效催化特性的酶，能够将磷脂酰胆碱（PC）和甘油转化为磷脂酰甘油（PG）。PG作为一种罕见的磷脂，因其良好的生物亲和性、可降解性和形成脂质体的能力，被广泛应用于药物载体、工业乳化剂以及护肤产品中。同时，PG在维持肺泡结构和功能稳定方面也展现出重要的生物学意义，尤其在新生儿肺部疾病的诊断与治疗中。然而，尽管存在三种主要的PG制备方法——溶剂提取、化学合成和酶催化合成，目前酶催化法的产率仍无法满足工业化需求。因此，本研究旨在通过定向进化技术对PLD进行分子修饰，以提高其转磷酰基活性并减少水解副反应，从而实现高效PG的合成。

### 酶催化合成的挑战与研究进展

PLD在催化反应中可以执行两种不同的反应路径：一种是磷脂酰转移反应，用于合成磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）和PG；另一种是水解反应，当系统中存在水分时，PLD将PC水解为磷脂酸（PA）。水解副反应会显著影响PLD的转磷酰基效率，因此，减少水解反应成为提高PG合成效率的关键。目前，自由状态下PLD催化合成PG的产率仅能达到61.3%至64%（Li et al., 2018），这一结果尚不足以支持大规模工业应用。因此，研究者们不断探索如何通过分子修饰来优化PLD的催化性能。

近年来，研究者通过多种手段对PLD进行定向改造，以提高其催化效率。例如，Hu等人（2024）设计了P343A/Y383L突变体，通过增强底物结合口袋的灵活性，使SkPLD的催化效率提高了7.14倍。Damnjanovic等人（2013）发现，所有Streptomyces PLD中都存在一个保守的D40环结构，通过删除该环，可以提高PLD的热稳定性和PI产率。Masayama等人（2008）通过对W187、Y191和Y385三个氨基酸位点进行饱和突变，改变了PLD的底物特异性，使其能够合成PI。Samantha等人（2021）则通过改造Streptomyces antibioticus PLD（SaPLD），实现了1-PI的特异性合成。这些研究表明，通过分子修饰可以显著提高PLD的催化活性，但大多数研究集中在PI和PS的合成，而针对PG的定向改造尚未有相关报道。

### SaPLD的特性与研究背景

在众多PLD中，SaPLD（PDB ID: 2ZE4）因其较高的转磷酰基活性而受到关注。SaPLD在我们实验室构建的重组大肠杆菌（E. coli）系统中表现出高表达水平（Xiong et al., 2019; Xiong et al., 2018）。为了突破现有合成效率的瓶颈，本研究选择了PC和甘油作为底物，通过半理性设计策略对SaPLD的活性中心附近氨基酸进行精确的疏水性修饰。该策略结合了序列比对、分子对接和蛋白质通道计算，以筛选出具有显著增强转酰基活性的PLD突变体。通过深入的结构比较分析，我们发现活性中心附近的柔性环结构的构象重排是催化效率提升的关键机制。此外，我们还对优选突变体的酶学特性进行了系统研究，并对PG合成反应的条件进行了优化。

### 突变体的筛选与优化

在本研究中，我们通过半理性设计策略对SaPLD的活性中心附近氨基酸进行突变，重点选择了G381、V380、S382、G383、Y385、Y191、D190和W187这几个关键位点。通过对这些突变体的催化效率和PG产率进行评估，我们发现G381A突变体的PG产率最高，达到了82.3%，比野生型（WT）提升了约36%。这表明，对G381位点的修饰对提高PG产率具有显著效果。

为了进一步优化G381A的性能，我们对其酶学特性进行了系统研究。实验结果显示，G381A在较低温度（22-27°C）和碱性pH（7.5-8.0）条件下表现出更高的活性，这表明该突变体对极端环境具有更强的适应能力。此外，G381A的热稳定性在30-40°C范围内表现良好，但在50-60°C时，其转磷酰基活性显著下降。这一结果提示，尽管G381A在中温条件下表现出色，但在高温环境下可能面临结构稳定性问题。

在催化动力学方面，G381A的Km值比WT降低了7.6%，表明其对底物的亲和力更强。同时，G381A的Vmax值是WT的1.5倍，说明其催化效率显著提高。这些结果进一步验证了G381A在提高PLD催化效率方面的潜力。为了验证这一结论，我们通过分子对接和蛋白质通道计算，分析了G381A与底物PC和甘油的结合自由能。结果显示，G381A与PC的结合自由能为-5.3 kcal/mol，与甘油的结合自由能为-4.0 kcal/mol，而WT与PC和甘油的结合自由能分别为-3.7和-3.9 kcal/mol。结合自由能的降低意味着G381A对底物的亲和力更高，这可能是其催化效率提升的重要原因。

### 酶学特性与反应条件优化

为了进一步优化G381A的催化性能，我们对其反应条件进行了系统研究。首先，我们测试了不同有机溶剂对PG合成的影响。实验结果表明，使用乙醚作为有机相时，PG的产率最高，因此我们将其确定为最优反应条件之一。此外，我们还研究了反应温度对PG产率的影响。随着温度从22°C升高至32°C，PG产率逐步增加，但在超过32°C后开始下降。这可能是由于乙醚的沸点较低，当温度超过其沸点时，会因挥发而影响反应的进行。因此，我们选择了32°C作为最优反应温度。

在pH值方面，实验发现PG产率在pH 4.5至8.5范围内呈现先上升后下降的趋势，峰值出现在pH 8.0。这表明碱性条件更有利于G381A的催化反应。同时，PG产率在pH 5.5至7.0之间保持稳定，说明G381A具有较宽的pH适应范围。因此，我们确定pH 8.0为最优反应条件。

在两相体积比方面，实验发现当水相与有机相的比例为1:2.5时，PG的产率最高。这一结果可能与水相和有机相之间的界面相互作用有关。过量的水相可能导致水解副反应增加，从而抑制PG的形成。而过量的有机相则可能改变酶的构象，影响其活性。因此，控制两相体积比是优化PG合成的重要因素。

在底物摩尔比方面，实验表明随着甘油与PC的摩尔比从20:1增加到160:1，PG的产率逐步上升，最终达到96%。这说明甘油浓度对PG的合成具有重要影响。当甘油浓度超过一定阈值后，其对反应的促进作用趋于饱和，因此我们选择了160:1的底物摩尔比作为最优条件。

在酶负载量方面，随着酶用量的增加，PG的产率也逐步提高，但当酶负载量超过100 μL时，产率趋于稳定。这表明，G381A在一定范围内对底物具有较高的催化效率，但其活性也存在饱和点。因此，我们确定100 μL的酶负载量为最优条件。

在Ca2?浓度方面，实验发现随着Ca2?浓度的增加，PG的产率逐步提高，但当浓度超过30 mmol/L后，产率趋于稳定。这说明Ca2?对G381A的转磷酰基活性具有一定的促进作用，但并非其催化反应的必需条件。因此，我们选择了30 mmol/L的Ca2?浓度作为最优条件。

在反应时间方面，随着反应时间从1小时延长至3小时，PG的产率逐步增加，但当反应时间超过3小时后，产率开始下降。这可能是由于反应体系逐渐趋于平衡，水解副反应开始占据主导地位。因此，我们确定3小时为最优反应时间。

### 结构分析与催化机制

为了深入理解G381A催化效率提升的分子机制，我们对其结构进行了详细分析。通过同源建模和分子对接，我们发现G381A的活性中心附近存在一个重要的柔性环结构（loop 379-385）。该环的构象重排可能是G381A催化效率提升的关键因素。在野生型（WT）结构中，G381与W187之间存在范德华相互作用，而G381A的突变使得这一相互作用消失，从而增加了环的灵活性。这种构象变化不仅扩大了催化口袋的体积，还增强了酶与底物的结合能力，特别是对较大分子的PC。此外，通过计算催化口袋的体积，我们发现G381A的催化口袋体积比WT增加了约22.8%（从447 ?3增加到549 ?3），这一变化进一步支持了其催化效率提升的假设。

在结构分析中，我们还发现G381A的活性中心周围存在三个关键的水分子（wat519、526和535），它们与活性中心形成氢键。这一发现提示我们，水分子在PLD的催化过程中可能起到重要作用。通过分子对接分析，我们发现G381A与PC的结合自由能比WT更低，这表明其对PC的亲和力更强。同时，G381A与甘油的结合自由能也比WT更低，说明其对甘油的亲和力同样增强。这些结果进一步验证了G381A的催化效率提升与底物亲和力增强之间的关系。

### 工业应用与未来展望

本研究通过定向进化技术成功构建了G381A突变体，并在5-L发酵罐中实现了97.6%的PG产率，这一结果目前是最高水平的。这一成果不仅展示了PLD定向改造在工业生产中的潜力，也为其他罕见磷脂的合成提供了新的思路。此外，本研究还表明，通过控制反应条件（如有机相、温度、pH、两相体积比、底物摩尔比、酶负载量、Ca2?浓度和反应时间），可以进一步优化PLD的催化效率，从而提高PG的产率。

未来的研究方向可以包括对PLD的热稳定性和非水相体系的进一步探索。通过引入更多的分子修饰策略，例如改变酶的结构或引入其他辅因子，有望进一步提高PLD的催化效率。此外，针对不同底物的定向改造也可能成为研究的重点，以拓展PLD在磷脂合成中的应用范围。随着生物技术的发展，PLD的定向改造将成为推动工业磷脂合成的重要手段，为制药、食品和化妆品行业提供更加高效、环保的生产方式。