人葡萄球菌NU-7中性脲酶的高效生产与固定化：中国黄酒中氨基甲酸乙酯的绿色减排策略

本研究针对黄酒中致癌物氨基甲酸乙酯(EC)污染问题，通过筛选人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)NU-7菌株，优化其中性脲酶发酵条件（葡萄糖3.5g/L，蛋白胨2.75g/L，金属离子0.2g/L，尿素10g/L，pH7），并采用海藻酸钠(20g/L)-氯化钙(50g/L)-戊二醛(5.30g/L)-壳聚糖(2.5g/L)体系固定化酶。固定化酶在pH4-7和197.3g/L乙醇中保持稳定，72小时内使黄酒尿素降低18mg/L，EC减少119.1μg/L，且不影响风味品质，为发酵食品EC控制提供创新解决方案。

　　

在传统发酵食品黄酒中，乙醇与尿素反应生成的氨基甲酸乙酯(EC)被国际癌症研究机构列为2A类致癌物，成为困扰产业发展的重大安全隐患。黄酒中的尿素含量显著高于其他酿造酒类，使得EC形成风险尤为突出。虽然现有的EC控制方法包括酶法处理、工艺优化、低尿素酵母选育和物理吸附等策略，但酶法应用仍面临风味改变和成本高昂的挑战。特别是目前广泛使用的酸性脲酶，虽然适应酸性环境但活性较低，而中性脲酶虽活性高却稳定性不足。

为破解这一难题，研究人员从绍兴古越龙山黄酒厂小麦曲发酵室分离到一株人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)NU-7，该菌株能产中性脲酶，可有效控制尿素水平并减少EC形成。研究团队通过单因素实验和响应面法优化发酵条件，确定了最佳培养基配方，并采用海藻酸钠-氯化钙-戊二醛-壳聚糖体系对酶进行固定化处理，系统评估了固定化酶的催化性能、稳定性和应用效果。

研究采用的主要技术方法包括：从黄酒发酵环境采样进行中性脲酶产生菌的筛选鉴定；通过单因素和响应面实验优化发酵条件；超声辅助酶提取和硫酸铵分级沉淀纯化；海藻酸钠包埋-交联法制备固定化酶；Berthelot比色法测定脲酶活性；GC-MS分析EC和风味物质含量。

3.1. 中性脲酶筛选与16S rDNA鉴定

从黄酒发酵环境中筛选到161株中性脲酶产生菌，其中NU-7菌株酶活性最高达97.02μkat/L，经形态学、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定为人葡萄球菌。

3.2. 菌株生长曲线与发酵条件优化

NU-7在32小时达到最大生物量5.18g/L，24小时酶活性最高为112.57μkat/L。确定最佳碳源为葡萄糖(20g/L)，氮源为蛋白胨(40g/L)，最适pH7，金属离子Ni²⁺和Mn²⁺浓度0.2g/L，尿素浓度10g/L。

3.3. 响应面优化

通过Plackett-Burman和Box-Behnken实验设计，确定最佳发酵条件为葡萄糖3.5g/L、蛋白胨2.75g/L、金属离子0.2g/L、pH7、尿素10g/L，使酶活性提高到248.6μkat/L，较优化前提高2.56倍。

3.4. 酶提取条件优化与纯化

超声破碎最佳条件为功率540W、时间80分钟，酶活性达109.51μkat/L。硫酸铵分级沉淀在257.5g/L浓度时相对酶活性最高，经DEAE-Cellulose和Superdex G-75层析纯化，酶活性分别为129.0μkat/L和114.3μkat/L。

3.5. 固定化酶制备与表征

确定最佳固定化条件：海藻酸钠20g/L、氯化钙50g/L、戊二醛5.30g/L、壳聚糖2.5g/L。固定化酶活性达28057.936μkat/kg，且在pH4-7和高达197.3g/L乙醇浓度下保持稳定。

3.6. 酶学性质研究

固定化酶最适温度35°C，最适pH6，温度稳定性和pH稳定性显著优于游离酶。有机酸和乙醇耐受性增强，Mn²⁺、Co²⁺、Mg²⁺对酶有激活作用。固定化酶在4°C保存30天后仍保持124.3μkat/kg活性，可重复使用5.5小时。

3.7. EC控制效果

固定化酶处理72小时后，黄酒中尿素降低18mg/L，EC含量从149.71μg/L降至30.61μg/L，减少119.1μg/L，而游离酶处理效果不显著。

3.8. 风味分析

GC-MS分析20种核心风味物质显示，固定化酶处理对黄酒风味无显著影响，保持了产品的感官品质。

3.9. 研究结论与意义

该研究成功优化了人葡萄球菌NU-7中性脲酶的生产工艺，开发了高效固定化方法，解决了酶在黄酒酸性高乙醇环境中的稳定性问题。固定化酶能有效降解尿素，间接降低EC含量，且不影响黄酒风味，为发酵食品中EC的控制提供了切实可行的技术方案。该技术不仅适用于黄酒，也可推广到其他发酵酒类和食品的安全生产中，具有重要的产业应用价值和食品安全意义。研究成果发表在《LWT》（食品科学与技术领域重要期刊），为酶法控制食品安全危害物提供了新的思路和方法。