靶向铜绿假单胞菌生物膜：新型核酸适配体的筛选及其结合蛋白的鉴定与互作机制解析

本研究针对铜绿假单胞菌生物膜耐药性强、传统抗菌手段效果有限的问题，通过SELEX技术筛选出两种高效降解生物膜的核酸适配体（T1和T2），降解率分别达69.21%和70.50%。研究进一步通过磁分离、质谱分析和分子对接技术鉴定出三种关键结合蛋白（过氧化氢酶、EF-Tu和转醛醇酶），并阐明其相互作用机制，为生物膜相关感染的防治提供了新策略。

　　

在微生物的世界里，细菌们常常不会"单打独斗"，而是选择组建一个名为"生物膜"的精密社区。这种由细菌细胞和胞外聚合物（EPS）构成的结构化群落，就像是细菌们的"堡垒"，能够显著增强其对消毒剂、抗生素和恶劣环境的耐受能力。其中，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）作为一种常见的水生生物膜产生病原体，不仅广泛存在于水、土壤和空气中，还能感染鱼虾等水生生物，更是常见的食品腐败菌，可引起水产品的腐败变质。

铜绿假单胞菌通过群体感应调节EPS分泌，形成致密的多糖-蛋白质生物膜，显著增强其环境适应性、应激抗性和感染率。传统的β-内酰胺类和氟喹诺酮类抗生素虽能抑制浮游细菌，但对细菌生物膜的作用有限。更令人担忧的是，长期使用抗生素可能导致超级耐药菌株的产生，如多重耐药的铜绿假单胞菌已被世界卫生组织列为"优先病原体"。因此，开发针对铜绿假单胞菌生物膜的新型降解和治疗方法迫在眉睫。

在这项发表于《LWT》的研究中，研究人员通过指数富集的配体系统进化（SELEX）技术，筛选出两种能够有效降解铜绿假单胞菌生物膜的核酸适配体，并深入研究了其与靶标蛋白的相互作用机制，为生物膜相关感染的防治提供了新的理论基础和技术支持。

研究人员主要采用了SELEX筛选技术、磁分离技术、SDS-PAGE蛋白分析、质谱鉴定和分子对接分析等关键技术方法。菌株来源为集美大学水产学院病原微生物实验室保藏的铜绿假单胞菌及其他七种对照菌株。

3.1. SELEX筛选候选铜绿假单胞菌生物膜降解适配体

通过三轮SELEX筛选，研究人员成功富集了具有生物膜降解能力的适配体。筛选产品的生物膜降解率从第一轮的15-23%显著提高到第三轮的40-46%，表明在筛选过程中生物膜降解适配体的比例不断增加。高通量测序结果显示，大多数高频序列（HFSs）为82核苷酸长的ssDNA，通过相对重要指数（IRI）分析，最终筛选出两个主导序列（T1和T2）作为候选适配体。

3.2. 适配体及其组合的生物膜降解效果

T1和T2适配体对铜绿假单胞菌生物膜表现出高效的降解作用，降解率分别为69.21%和70.50%。值得注意的是，这两种适配体对三种弧菌（鳗弧菌、溶藻弧菌和哈维弧菌）、大肠杆菌、嗜香鱼假单胞菌、迟缓爱德华菌和嗜水气单胞菌的生物膜降解率均低于20%，显示出极高的靶标特异性。T1+T2适配体组合的降解率为73.3±3.0%，与单独使用时的降解率无显著差异，表明T1和T2可能具有相同或相似的结合位点和降解机制。

四环素、T1+四环素和T2+四环素组合的降解率分别为15.1±1.6%、84.8±2.4%和84.5±2.9%，约等于它们各自效果的总和，表明两种适配体与四环素可能作用于生物膜的不同位点，具有独立且互不干扰的生物膜降解机制。

3.3. 适配体结合蛋白的分离与鉴定

通过磁分离和SDS-PAGE分析，研究人员从破碎的铜绿假单胞菌生物膜中分离出T2结合蛋白。经过4-8次洗涤后，55、43和34 kDa处的蛋白条带仍然清晰可见，表明这些位置的蛋白与T2具有高亲和力。质谱分析最终鉴定出这三种蛋白分别为过氧化氢酶（catalase，55 kDa）、延伸因子-Tu（EF-Tu，43 kDa）和转醛醇酶（transaldolase，34 kDa）。

3.4. T2结合蛋白的特征

根据等电点和蛋白类型，这三种T2结合蛋白被鉴定为稳定的亲水性酸性蛋白。亚细胞定位分析表明，过氧化氢酶主要位于细胞质和周质中，而EF-Tu和转醛醇酶主要位于细胞质中。

3.5. T2及其结合蛋白的结构与相互作用

T2适配体呈现复杂的"L"型构型；过氧化氢酶外部有多个柔性肽链；EF-Tu由两个不同的含α螺旋和β折叠的组件组成；转醛醇酶则刚性紧凑，主要包含α螺旋结构。所有三种结合蛋白都与T2共享一个结合位点，并通过氢键和静电相互作用进行结合。

在过氧化氢酶-T2复合物中，Arg243的N与碱基DA73的O之间形成氢键，Arg243的N⁺与碱基DC74的O^?之间形成氢键和静电相互作用。在EF-Tu-T2复合物中，Lys328的N与碱基DG93的O^?之间形成氢键和静电相互作用，Lys328的C与碱基DG93的O^?之间形成静电相互作用。在转醛醇酶-T2复合物中，Arg272的N⁺与碱基DC37的N之间形成氢键和静电相互作用。

本研究通过SELEX技术成功筛选出两种能够高效降解铜绿假单胞菌生物膜的核酸适配体（T1和T2），降解率分别达到69.21%和70.50%，且对非靶标生物膜的降解率均低于20%，显示出极高的特异性。研究进一步鉴定出三种T2结合蛋白：过氧化氢酶、EF-Tu和转醛醇酶，并深入解析了它们与T2适配体之间的相互作用机制。

过氧化氢酶是铜绿假单胞菌中的关键酶，通过催化H₂O₂分解为H₂O和O₂来抑制H₂O₂氧化，维持生物膜的氧化还原平衡，保护浮游和生物膜细胞免受H₂O₂损伤。EF-Tu主要负责在蛋白质合成过程中将氨酰-tRNA运输到核糖体的A位点，是蛋白质翻译的关键因子，同时还参与细菌细胞的初始粘附。转醛醇酶参与糖酵解和磷酸戊糖途径，是葡萄糖代谢的关键酶，同时还参与UDP-葡糖胺（EPS前体）的合成。

T2适配体与这些关键蛋白的结合，可能通过抑制过氧化氢酶活性降低生物膜的H₂O₂抗性，抑制EF-Tu介导的蛋白质合成和细菌粘附，以及干扰转醛醇酶参与的EPS合成，从而实现对铜绿假单胞菌生物膜的有效降解。

这项研究不仅为铜绿假单胞菌生物膜的防治提供了新的策略，也为开发针对其他病原菌生物膜的核酸适配体疗法提供了重要参考。虽然适配体作为外源DNA在生物体内的稳定性和安全性仍需进一步评估，但其高效性和特异性显示出在生物膜防治领域的良好应用前景。未来研究可进一步探索这些适配体在体内的效果，以及它们与其他抗菌剂的协同作用，为临床抗生物膜治疗提供更多选择。