基于京尼平交联大豆蛋白淀粉样纤维-壳寡糖纳米颗粒的Pickering乳液构建及其稳定机制研究

本研究针对食品级Pickering乳液稳定剂开发需求，通过天然交联剂京尼平（GNP）共价连接大豆蛋白淀粉样纤维（SAFs）与壳寡糖（COS），构建新型纳米颗粒（S-CNPs）。系统探究pH与质量比对颗粒理化特性及乳化/发泡性能的影响，发现pH7、SAF:COS=1:2条件下制备的复合颗粒可显著提升β-胡萝卜素包封率（83.9%）与乳液长期稳定性，为疏水性活性成分递送系统设计提供新策略。

　　

在食品、医药和化妆品工业中，Pickering乳液因其由胶体颗粒不可逆吸附在油水或气水界面而形成的高稳定性体系备受关注。与传统乳化剂相比，颗粒稳定剂具有更高的解吸能垒，可有效抑制奥斯特瓦尔德熟化和聚结现象。然而，无机纳米颗粒（如二氧化硅、碳酸钙）虽被广泛研究，但其生物相容性和食品安全性限制了在可食用乳液中的应用。因此，开发食品级胶体颗粒（如蛋白质/多糖基颗粒）作为乳化剂成为研究热点。

大豆蛋白淀粉样纤维（Soy protein amyloid fibrils, SAFs）是通过大豆分离蛋白（Soy protein isolate, SPI）在特定条件（主要是加热和pH调节）下经过可控变性和自组装形成的高度有序、高长径比的纳米纤维。研究表明，植物蛋白淀粉样纤维能在油水界面形成高内聚力的纤维网络，具有优异的机械强度，可有效抵抗乳液聚结、絮凝、相分离和奥斯特瓦尔德熟化。关键在于，SAFs网络包封油滴后显著增加了分散相油滴的有效体积和局部粘度，凸显了SAFs在稳定界面方面的显著效率。

然而，蛋白质的功能特性可通过与其他食品成分（尤其是碳水化合物）形成复合物或结合来增强。蛋白质-碳水化合物复合物通常通过物理相互作用（如静电吸引、氢键和/或疏水吸引）结合在一起，这些作用在环境或溶液条件改变时可能解离。为解决这一问题，可形成共价交联的蛋白质-碳水化合物缀合物，其对条件变化更具抵抗力。先前研究已证实，SAFs可通过美拉德诱导的糖基化和自由基介导的接枝反应与葡聚糖和表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate, EGCG）共价连接，以提高乳液稳定性。然而，利用天然交联剂将SAFs与壳寡糖（Chitooligosaccharides, COS）进行共价修饰以稳定Pickering乳液或泡沫的研究尚未探索。京尼平（Genipin, GNP）是一种天然交联剂，是一种可从栀子果实中分离的环烯醚萜衍生物。与合成交联剂（如戊二醛、甲醛和环氧化合物）相比，京尼平具有更好的生物相容性、生物可降解性和毒性特征。此外，京尼平还具有多种潜在有益特性，包括抗炎、抗菌、抗氧化、抗血栓和肝保护作用。因此，在食品应用中使用这种交联剂而非合成交联剂备受关注。

本研究推测SAFs与COS交联后其乳化性能和发泡特性可进一步提高，且用这种新型蛋白质基颗粒制备的Pickering乳液应更稳定。为验证这一假设，首先合成了京尼平桥联的SAFs/COS复合纳米颗粒。以这些纳米颗粒为稳定剂，探索了其稳定气水界面的潜力，并制备了食品级Pickering乳液。此外，还全面评估了β-胡萝卜素的包封效率和乳液的储存稳定性。预计本研究将拓宽大豆蛋白在纳米颗粒工程领域的应用范围，并为疏水性生物活性化合物递送系统的设计和开发提供基础见解。

为开展本研究，作者主要采用了以下关键技术方法：通过碱溶酸沉法从大豆中提取SPI；利用酸热法（pH 1.6, 80°C, 22 h）制备SAFs；以京尼平为交联剂，在不同pH（6、7、8）和SAF:COS质量比（2:1、1:1、1:2）条件下制备SAF-COS共价缀合物，并辅以超声处理（400 W, 5 min）形成纳米分散体；采用动态光散射技术分析颗粒粒径、多分散指数（PDI）和ζ-电位；通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱（二维和三维）分析缀合反应；使用SDS-PAGE评估分子量特性；通过光学显微镜、原子力显微镜（AFM）和激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）观察微观结构；测定乳化活性指数（EAI）、乳化稳定性指数（ESI）、发泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）；制备并表征了以S-CNPs为稳定剂的O/W型Pickering乳液，包括其流变特性、接触角、包封效率（EE）、粒径分布以及使用Turbiscan稳定性分析仪评估储存稳定性。

3.1. SAF-COS缀合物和Pickering乳液的形成

通过酸热反应使SPI分子解折叠和自组装形成SAFs。京尼平的加入促进了SPI和COS分子上游离氨基之间的亲核加成反应，从而导致共价缀合物的形成。高强度超声处理有助于破碎大的聚集体，从而形成SAF-COS纳米颗粒（S-CNPs）。这些纳米颗粒吸附在油水界面，形成围绕油滴的界面涂层，有助于提高稳定性。

3.2. SAF-COS缀合物的理化性质

动态光散射显示，SPI样品呈双峰分布，SAFs呈单峰分布（约200 nm），而缀合物呈单峰分布（400–700 nm）。pH6-GNP-2:1和pH8-GNP-1:2样品具有相对狭窄的单峰。平均粒径在400至800 nm之间，受制备pH和生物聚合物组成的影响。ζ-电位测量表明，所有颗粒在所用pH条件下均带有相对较低的负电荷。pH7组的ζ-电位值普遍较低，归因于羧基解离增强和适度的交联允许更多电离羧基暴露。

3.3. SAF-COS缀合反应的表征

UV-Vis光谱在280 nm处有特征吸收峰，SAFs的峰强度显著高于SPI。对于SAF-COS缀合物，在595 nm处出现一个新的吸收峰，归因于缀合反应过程中发色团的产生。595 nm处的吸光度随着制备pH的降低而降低，表明京尼平交联反应在更酸性条件下效率较低。动力学监测表明，共价缀合物的吸光度随时间增加，而非共价复合物则无此现象，25 h后反应趋于稳定。

3.4. SAF-COS缀合物的乳化和发泡特性

SAFs的EAI和ESI值显著高于SPI。物理混合样品的乳化性能略有增强。京尼平交联后，乳化活性和稳定性显著改善。性能取决于制备pH和组成，pH7和SAF:COS=1:2时表现最佳。发泡特性方面，SAFs的FC和FS值显著高于SPI。共价缀合物在FC和FS上均有显著改善，pH7和SAF:COS=1:2时最佳。泡沫衰减曲线和微观结构分析进一步证实了其优越的稳定性。

3.5. SAF-COS缀合物的微观结构特征

SDS-PAGE分析显示，SAFs在20-75 kDa范围内的条带消失，在11 kDa以下出现新条带。SAF-COS缀合物中出现更高分子量组分（15 kDa），表明成功交联。荧光光谱分析显示，与SPI相比，SAFs的最大发射波长发生红移，而缀合物发生蓝移，表明COS引起SAFs构象变化，使更多酚基团埋入疏水内部。三维荧光光谱显示，缀合物的峰1和峰2强度显著降低。

3.6. SAF-COS缀合物形成的Pickering乳液的性质

3.6.1. 流变特性

所有乳液均表现出剪切稀化行为。缀合物稳定的乳液具有更高的粘度，pH7-GNP-1:2样品初始粘度最高。Ostwald-de-Waele模型拟合显示所有乳液均具有剪切稀化行为（n < 1）。动态剪切模量测量表明，所有乳液的储能模量（G′）均高于损耗模量（G″），表现出主要的弹性特征。pH7-GNP-1:2乳液具有最高的G′和G″值。

3.6.2. 液滴尺寸分布和Pickering乳液的微观结构

以S-CNPs稳定的Pickering乳液呈绿色，归因于京尼平交联产生的蓝色染料与葵花籽油中的黄色色素混合。光学显微镜图像显示，SPI乳液油滴较大，间距大；SAFs乳液油滴较小、均匀分散且紧密堆积；S-CNPs乳液油滴更小、更均匀、更紧密堆积。示意图展示了S-CNPs在油水界面的吸附、吸附和界面重排过程。

3.6.3. Pickering乳液的共聚焦荧光显微镜和表面特性分析

CLSM图像显示乳液具有O/W结构，油滴（红色）被厚厚的蛋白质富集层（绿色）包围。水性相中呈现绿色，表明存在蛋白质丰富的凝胶网络。缀合物稳定的乳液油滴尺寸更均匀，堆积更紧密。接触角测量表明，所有样品的接触角均超过90°，Non-treated样品为75.1°，缀合物稳定的乳液接触角更接近90°。包封效率测定显示，共价交联组的EE显著高于其他组。

3.6.4. Pickering乳液的储存稳定性

Turbiscan稳定性分析表明，在储存过程中，乳液底部的背散射光（BS）减少，顶部增加，表明油滴向上移动。pH7-GNP-1:2缀合物制备的Pickering乳液表现出最佳的稳定性。TSI值计算表明，SPI和SAFs乳液的TSI指数随时间增加较快，而不同缀合物稳定的Pickering乳液的TSI值随时间增加较少。显微镜结构图像和体积加权平均直径（D_4,3）进一步证实了储存稳定性的差异。

本研究成功通过酸热处理（pH 1.6, 80°C, 22 h）制备了大豆蛋白淀粉样纤维（SAFs），并利用京尼平作为交联剂，将壳寡糖（COS）共价连接到SAFs上制备了缀合物。这些缀合物以相对较小的阴离子颗粒形式存在，能够吸附到油水或气水界面，从而具有良好的乳化和发泡性能。基于理化和功能特性的综合分析，缀合物的最佳制备条件为pH 7和SAF与COS质量比1:2。COS连接到SAFs上改变了蛋白质纤维的结构和表面疏水性，增强了其水分散性和表面活性。由S-CNPs构建的Pickering乳液的流变特性表现出更高的粘度和弹性模量，这归因于存在更小、更紧密堆积的油滴，以及分布在整个水相的蛋白质丰富网络。

该研究不仅为食品乳液的形成和稳定提供了新型Pickering稳定剂，也促进了其在更广泛领域（递送系统或生物医学泡沫）的应用。然而，仍需进行更深入的研究以确定这种乳化剂能否实现经济规模化生产。