Cu-TCPP-Mn纳米酶复合富血小板血浆水凝胶在感染伤口愈合中的应用

《Materials & Design》：Cu-TCPP-Mn nanozymes composite platelet-rich plasma hydrogel for infected wound healing

本研究开发了一种新型多功能水凝胶（CHPM），由氧化透明质酸和羧甲基壳聚糖复合而成，并负载血小板富血浆和铜-卟啉锰纳米酶。该水凝胶通过动态Schiff碱交联形成可调粘弹性结构，兼具优异生物相容性和可注射性。实验证实其协同作用可有效清除活性氧、抑制炎症反应、促进血管生成及胶原沉积，显著加速感染伤口愈合，且无显著毒性或器官损伤。该材料为感染伤口治疗提供了创新生物活性敷料方案。

　　在当前的医学研究中，感染性伤口的治疗仍然是一个重要的临床挑战。这种类型的伤口不仅影响患者的恢复速度，还可能导致严重的并发症，如败血症和多器官功能障碍。因此，开发一种新型的伤口修复材料成为研究的重点。本研究介绍了一种多功能的水凝胶，它由氧化透明质酸（OHA）和羧甲基壳聚糖（CMCS）组成，并结合了富血小板血浆（PRP）和铜-四（4-羧基苯基）卟啉-锰（Cu-TCPP-Mn）纳米酶，旨在实现更高效的伤口修复和抗感染效果。这种水凝胶通过席夫碱反应合成，将OHA的醛基与CMCS的羧甲基进行交联，形成具有可调节流变特性和良好生物相容性的动态网络。通过引入PRP，水凝胶能够富含生长因子，显著促进组织再生；而Cu-TCPP-Mn纳米酶则能有效清除活性氧（ROS），通过模拟超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的活性。此外，水凝胶还能调节巨噬细胞极化，PRP与Cu-TCPP-Mn的协同作用有助于减轻感染性伤口的持续性炎症。一系列实验表明，CHPM水凝胶能够增强细胞增殖、迁移和分化，调节炎症反应，并加速伤口愈合。该水凝胶还表现出优异的吸水能力、自愈性能和形状记忆功能。这些结果突显了该水凝胶作为创新生物活性敷料在感染性伤口修复中的潜力，并在临床抗菌应用方面展现出广阔前景。

感染性伤口的治疗需要解决多个问题。首先，尽管系统性抗生素可以迅速控制感染，但血液中的药物仅有60%至70%能够有效作用于伤口部位，其余则可能引发全身性副作用，如肾和肝毒性。其次，机械清创虽然可以暂时去除坏死组织，但反复操作可能损伤新生的肉芽组织，延缓愈合过程。第三，局部抗生素虽然能提高药物浓度，但其剧烈释放会破坏伤口的微环境平衡，可能导致多重耐药菌株的出现。因此，开发一种具有时空可控释放特性的新型水凝胶递送系统，使其能够同时调节抗菌、抗炎和修复促进功能，成为突破现有治疗局限的关键研究方向。

自1962年Winter提出湿润伤口愈合理论以来，关于伤口修复环境的基本、转化和临床研究取得了显著进展。其中，水凝胶因其独特的“结构-功能”耦合特性和三维多孔网络结构而备受关注。这种结构模仿了天然细胞外基质，为细胞迁移和新生血管形成提供了机械支持。水凝胶的高吸水性可以维持适度湿润的环境，同时有效吸收伤口渗出物。这些特性可以通过调整聚合物骨架、浓度比例和交联方法进行精细调控。此外，水凝胶可以与生物活性分子、药物或纳米酶结合，形成定制化的递送系统，从而为不同类型的伤口提供针对性的治疗方案。

基于多糖的材料因其良好的生物相容性和功能性设计能力，在伤口修复水凝胶的构建中备受青睐。壳聚糖作为一种代表性的天然多糖，具有广谱抗菌和止血性能，但由于其极低的水溶性，在临床应用中受到一定限制。而羧甲基壳聚糖（CMCS）通过破坏分子内氢键网络，显著提高了水溶性，同时暴露了后续交联的活性氨基基团。虽然透明质酸（HA）因其出色的保湿性和生物相容性而受到关注，但其缺乏反应性官能团限制了其在伤口修复中的应用。相比之下，氧化透明质酸（OHA）通过引入醛基，能够通过席夫碱反应与CMCS中的羧甲基形成交联，构建OHA/CMCS（CH）水凝胶。然而，单一水凝胶屏障系统难以完全清除感染病灶。因此，将水凝胶的机械保护优势与程序化药物释放系统相结合，成为打破感染愈合恶性循环的有吸引力方案。

纳米酶技术作为传统抗生素的可行替代方案，近年来逐渐受到重视。纳米酶是一类新型的仿生催化剂，兼具天然酶的催化特性以及增强的稳定性和可调性。此外，纳米酶克服了天然酶在成本、回收和储存方面的限制，同时具有更高的稳定性。这些纳米酶能够对抗细菌、破坏生物膜、减少伤口感染，并规避传统抗生素常见的耐药问题。铜-四（4-羧基苯基）卟啉-锰（Cu-TCPP-Mn）纳米片是一种有效的金属-有机框架，能够模拟SOD和CAT的酶活性。这一特性使其特别适用于对抗感染性伤口中高氧化应激的病理特征。Cu-TCPP-Mn纳米片已被用于治疗心肌炎症性疾病，但尚未应用于皮肤组织。因此，本研究将Cu-TCPP-Mn纳米酶整合进CH水凝胶网络中，开发了一种动态响应的智能递送系统，创造有利的愈合环境并实现持续的局部释放，为感染控制提供了一种非抗生素的解决方案。

感染性伤口的成功修复依赖于炎症调节和病原体清除，并需要在高代谢微环境中重新建立组织再生程序。急性感染性伤口在修复阶段表现出对细胞增殖和新生血管形成的高度需求，这种需求高度依赖于生长因子（GF）的时空精准供应。富血小板血浆（PRP）是从患者血液中提取的，能够防止免疫排斥反应，已被广泛应用于多个临床领域，包括牙科和骨科。PRP富含血小板，这些血小板在激活后会释放关键的GF，如TGF-β、PDGF和VEGF。这些因子在促进细胞增殖、分化、上皮化和巨噬细胞极化方面起着至关重要的作用，使得基于PRP的水凝胶在感染性伤口修复中特别有效。然而，游离的PRP半衰期较短，容易被蛋白酶快速降解。这些限制可以通过将PRP引入CH水凝胶基质中加以克服，确保GF在伤口愈合过程中被高效利用。

本研究首次探讨了将纳米酶和PRP整合进CH水凝胶基质中以加速伤口愈合的可行性。Cu-TCPP-Mn纳米酶的整合允许受控药物释放，提供抗炎、抗氧化、抗菌、ROS清除和促血管生成作用，从而协同增强感染性伤口修复并改善治疗效果。PRP富含氨基基团，这些基团能够与水凝胶中的醛基形成席夫碱键，有助于持续释放多种GF。CH水凝胶中的动态席夫碱键还赋予其独特的自愈特性，使其适用于各种形状的伤口，而不会发生位移。因此，本研究探索了一种多功能材料系统，旨在提高治疗效果（见图1）。一种新型的OHA/CMCS/PRP（CHP）水凝胶被制备，其中加载了Cu-TCPP-Mn纳米片，以协同方式有效治疗急性感染性伤口。通过一系列实验，全面评估了水凝胶的物理化学特性和治疗效果。

在材料部分，研究使用了HA、CMCS、过碘酸钠、H2TCPP、Cu(NO3)2·3H2O、二甲基甲酰胺（DMF）、MnCl2·4H2O、乙二醇和苯甲酸等。HUVEC、HaCaT细胞、RAW264.7细胞和CCK-8细胞计数试剂盒来自Servicebio Technology。人皮肤成纤维细胞（HSF）来自iCell Bioscience。ROS检测和calcein/碘化丙啶（PI）检测试剂盒也来自Servicebio Technology。抗体来自Proteintech和Servicebio Technology。所有实验均使用Milli-Q级水进行。

在纳米酶的表征部分，Cu-TCPP-Mn纳米酶的制备基于之前描述的方法。首先，将1.0 mL 10 mM Cu(NO3)2和2.0 mL 1.0 mmol/L H2TCPP分散在100 mL DMF中，并加入1.7 mmol BA以获得均匀的溶液。在甲基硅油中加热搅拌4小时以生成Cu-TCPP。随后，加入1.0 mL 10 mM MnCl2并在90°C下加热12小时以生成Cu-TCPP-Mn纳米片。为了合成纳米点，形成的沉淀物经过离心、三次乙醇洗涤和4小时超声处理。Cu-TCPP-Mn纳米片的形态和元素映射分析使用扫描电子显微镜（SEM）进行，而纳米点则使用透射电子显微镜（TEM）进行分析。纳米点的粒径更小，具有更稳定的化学性质和更好的表面效应，因此后续实验使用Cu-TCPP-Mn纳米点。元素特征分析通过X射线光电子能谱（XPS）进行。动态光散射（DLS）系统用于分析Cu-TCPP-Mn纳米点。傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于进一步表征纳米点。紫外-可见吸收光谱通过TECAN GENIOS微板阅读器（瑞士）获得。在充分表征Cu-TCPP-Mn纳米点后，评估其酶样活性，参考相关研究。

在水凝胶的制备和表征部分，OHA通过过碘酸钠氧化制备，方法参考了文献中的描述并进行了一些修改。首先，将4 mmol HA溶解在200 mL水中，加入1 M过碘酸钠溶液（10 mL）并磁力搅拌2小时。通过加入1 mL乙二醇停止反应，并继续搅拌1小时。随后，产品经过透析并冷冻干燥，得到白色蓬松的OHA，保存在-20°C。OHA的化学结构通过1H NMR和FTIR光谱进行分析。

对于水凝胶前驱体溶液，将5% OHA与不同浓度的CMCS（2%、4%和6%）结合，并在温和搅拌下通过席夫碱机制反应。随后，在室温下固化形成具有不同浓度的OHA/CMCS水凝胶。不同浓度分别命名为CH1（2% CMCS，5% OHA）、CH2（4% CMCS，5% OHA）和CH3（6% CMCS，5% OHA）。通过探索CH1、CH2和CH3的组合并进行机械强度测试，确定了最佳浓度比例。凝胶性能通过小瓶倾斜测试评估，注射性通过将水凝胶从注射器中推出进行测试。自愈性通过将两片染色的水凝胶在轻压下接触进行测试。流变性能通过流变仪（Haake Mars40）进行评估。吸水实验在不同时间点进行。由于CH2水凝胶表现出优越的流变性能，因此选择CH2水凝胶进行后续实验。为了制备激活溶液，将100 U的凝血酶与1 mL 10% CaCl2溶液混合，300 μL该溶液与30 μL PRP结合。PRP和Cu-TCPP-Mn纳米点被引入CH水凝胶中，制备得到CHP、OHA/CMCS@Cu-TCPP-Mn（CHM）和CHPM复合水凝胶。这些复合水凝胶随后进行冷冻干燥，并通过扫描电子显微镜（SE显微镜，Thermo Fisher Quattro S）进行结构表征。样品在液氮中淬火，并通过SEM评估其截面的微观结构。CH、CHP和CHPM水凝胶的化学结构通过FTIR进行表征。为了量化复合水凝胶中Cu-TCPP-Mn的释放，参考了之前的研究，使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）进行评估。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）进一步评估了PRP的释放，使用PDGF和VEGF作为代表性标记物。CHPM水凝胶表现出这些GF的持续释放，这可能是因为动态交联通过PRP中的氨基基团与OHA中的醛基相互作用，从而将PRP固定在水凝胶网络中。

在体外生物相容性评估部分，HUVEC、HaCaT和HSF细胞被接种并暴露于水凝胶提取物中。水凝胶前驱体粉末在紫外线下照射，随后在无菌条件下合成水凝胶。48小时后，细胞用calcein-AM/PI染色并成像。细胞活力通过CCK-8检测评估。CHPM水凝胶对HUVEC的细胞毒性在不同浓度梯度下进行评估，结果显示细胞活力基本未受影响。通过收集小鼠血液（使用肝素化管进行眼动脉穿刺）评估血相容性。血液在0.9% NaCl中洗涤至上清液澄清，然后将水凝胶提取物与稀释的红细胞悬液在37°C下孵育4小时以评估溶血。溶血率通过离心后的上清液计算。

在体外划痕实验中，HUVEC被接种并培养至达到90%汇合度。随后，使用移液器尖端在细胞单层上制造划痕。细胞被洗涤并培养于水凝胶提取物中。48小时后，观察细胞迁移到划痕区域的情况并拍照。使用ImageJ软件分析HUVEC的迁移情况。

在血管生成实验中，将基质凝胶在4°C下解冻，均匀涂抹在12孔板底部并固化。随后，将HUVEC以2×104细胞/孔的密度接种，并与水凝胶提取物共培养，以PBS作为对照。8小时后，使用calcein-AM染色细胞并成像。通过ImageJ软件量化血管形成情况。

在细胞ROS清除实验中，使用细胞渗透性荧光探针DCFH-DA评估水凝胶对HUVEC中ROS的调节能力。将HUVEC接种在六孔板中，随后用ROSup诱导20分钟以产生氧化应激，并与含有水凝胶的培养基共培养。随后，细胞用DCFH-DA染色并孵育40分钟，之后用荧光显微镜观察。

在巨噬细胞极化调节实验中，基于先前研究设计实验。RAW 264.7细胞被脂多糖刺激24小时以诱导M1极化（促炎状态）。通过免疫荧光和共聚焦显微镜评估M1和M2巨噬细胞标志物（iNOS，M1标志物；CD206，M2标志物）的变化。细胞在每组干预后用4% paraformaldehyde溶液固定30分钟，随后用0.1% Triton X-100通透，并用5% BSA封闭。细胞过夜孵育与iNOS和CD206的一抗，随后在避光条件下孵育二抗2小时。

在水凝胶的抗菌性能评估中，通过琼脂板计数法和显微镜及染色技术分析细菌形态变化。使用S. aureus和E. coli菌株进行抗菌测试。将细菌悬液与水凝胶混合并培养。随后，将稀释的细菌悬液均匀涂抹在固体营养琼脂板上，并在15小时后计数菌落。将细菌悬液与水凝胶孵育后，用2.5%戊二醛溶液固定3小时，之后进行梯度脱水处理，使用乙醇溶液从20%到100%。样品干燥后，使用SEM观察形态变化。进行细菌活/死染色实验，确认水凝胶对S. aureus和E. coli的杀菌效果。此外，通过结晶紫染色评估水凝胶对生物膜的破坏和抑制效果。在48孔板中，每个孔加入990 μL LB培养基和10 μL混合的S. aureus/E. coli悬液，并在72小时后培养形成生物膜。随后加入1 mL水凝胶提取物，并继续培养24小时。生物膜固定在甲醇中，用0.1%结晶紫染色，最后用33%乙酸酸化脱色。通过595 nm吸光度量化生物膜去除情况。进行时间杀灭实验以评估水凝胶对S. aureus和E. coli的抗菌能力。

在水凝胶的止血效果评估中，水凝胶在快速和持久止血中起着关键作用，形成覆盖伤口的屏障，从而为伤口恢复提供稳定的环境。使用小鼠尾部截断和肝脏出血模型评估CHPM水凝胶的止血效果。结果显示，CHPM水凝胶处理组在两种模型中均表现出出血量减少，显示出其有效的止血能力。这种效果归因于CHPM水凝胶的组织粘附性能，使其能够在伤口部位形成稳定的结合。此外，CHPM水凝胶中PRP的持续释放有助于局部止血。PRP中的血小板在伤口部位聚集，形成止血所需的必要血凝块，同时促进后续的组织修复。

在体内伤口愈合和组织学分析中，BALB/c小鼠被分配到不同的实验组，以评估CHPM水凝胶对感染性伤口愈合的促进作用。建立感染性伤口模型后，将CH、CHM、CHP和CHPM水凝胶应用于伤口，以3M水凝胶敷料作为对照，以研究不同水凝胶在治疗急性感染性伤口中的功能。实验结束后，将小鼠安乐死，收集伤口周围的皮肤组织进行进一步分析。有效的体内抗菌活性对于伤口治疗至关重要。在第3天，从每个伤口收集的细菌均匀涂布在琼脂板上进行培养。使用CHPM水凝胶处理的伤口表现出显著减少的细菌菌落（见图S16）。定量菌落计数确认了复合水凝胶实现了出色的杀菌率，与体外抗菌结果一致。这些结果表明，CHPM水凝胶具有强大的体内抗菌活性，并能有效清除细菌。

在体内胶原沉积和炎症反应分析中，胶原蛋白是真皮细胞外基质的关键组成部分，对于伤口愈合和瘢痕形成至关重要。使用Masson三色和Sirius Red染色技术评估愈合过程中的胶原沉积。结果表明，CHPM组的真皮中胶原纤维沉积显著增加，而对照组则表现出极少的胶原纤维（见图9）。炎症环境对伤口是否进展为慢性或非愈合性伤口起着决定性作用。IL-6水平升高会延长炎症反应，阻碍伤口愈合，而TNF-α则刺激免疫细胞的增殖和分化。ELISA结果表明，所有治疗组中TNF-α和IL-6的水平均下降，其中CHPM组下降最为显著。同时，抗炎细胞因子（IL-10）在所有治疗组中均升高，CHPM组的升高最为明显。这些结果表明，CHPM水凝胶在体内表现出显著的抗炎效果。免疫组织化学染色显示，CHPM水凝胶显著降低了TNF-α和IL-6的表达，表明其能有效调节创伤后的炎症反应。此外，PRP中的趋化因子和活性蛋白调节炎症反应，抑制过度炎症，并促进伤口愈合，从而提升了水凝胶在伤口治疗中的整体疗效。PRP与Cu-TCPP-Mn的协同作用进一步增强了抗炎能力。

在伤口处的新生血管形成是愈合过程中的关键环节，因为新毛细血管的形成能增强血液灌注，为组织提供必要的营养并清除代谢废物。使用免疫荧光染色（CD31、α-SMA）评估新生血管水平。结果显示，CHPM处理组的新生血管范围和密度显著增加，表明其促进了血管再生。这一改善可能是由于CHPM水凝胶中PRP和纳米点的持续释放，以及其通过调节巨噬细胞极化促进体内血管生成。因此，炎症反应被缓解，抗炎环境被增强，从而促进感染性皮肤伤口的愈合。水凝胶中的纳米点和PRP的活性成分可能影响巨噬细胞的M2极化，从而改善感染性伤口的愈合过程，与我们之前的实验结果一致。

在结论部分，本研究提出了一种新型的伤口敷料CHPM，通过将Cu-TCPP-Mn纳米点和PRP整合到OHA和CMCS的有机框架中。这种可注射水凝胶表现出优异的生物相容性、良好的流变和吸水特性，以及抗菌、止血和ROS清除活性。CHPM水凝胶增强了血管生成，减少了炎症，增加了M2巨噬细胞的比例，并促进了伤口愈合。将PRP和Cu-TCPP-Mn纳米点引入水凝胶的设计旨在最大化协同效应，使水凝胶比单一治疗更有效。研究结果表明，CHPM在急性感染性伤口的敷料应用中具有潜在的临床价值。这一进展在生物材料领域具有重要意义，并为再生医学及其他应用提供了一个多功能的治疗平台。

在伦理审批和参与同意部分，所有动物实验均获得空军军医大学动物伦理委员会的批准（批准号：IACUC-20240024）。

在CRediT作者贡献声明中，Han Chen负责撰写初稿和数据管理；Pu Yang和Yikun Ju负责撰写和审阅修改；Songjie Li负责数据管理；Xin Dan负责软件；Ping Xue和Xuanji Huang负责正式分析；Lanjie Lei负责项目管理和概念设计；Xing Fan负责资源和资金获取；Yang Li负责验证、监督和方法设计。

在资金支持部分，本研究得到了陕西省教育厅（项目编号：YJSZG2023134）和杭州市自然科学基金（项目编号：2024SZRYBH180001）的支持。