基于HPV VLP的RNA递送系统：协同沉默BCL-2并诱导非小细胞肺癌细胞线粒体凋亡的新策略

本研究针对非小细胞肺癌（NSCLC）凋亡抵抗和靶向治疗缺乏的难题，开发了一种四功能组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2。该体系通过SP5-2修饰的HPV病毒样颗粒（VLP）共载BCL-2 siRNA和阳离子线粒体 destabilization D-肽，实现了肿瘤靶向精准递送、高效细胞摄取、基因沉默（70% BCL-2敲低）和线粒体凋亡激活（91%细胞凋亡）。在A549荷瘤小鼠中抑制78.2%肿瘤生长且无系统毒性，为NSCLC精准治疗提供了协同递送新范式。

　　

非小细胞肺癌（NSCLC）作为肺癌中最常见的类型，约占所有肺癌病例的85%，一直是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管铂类化疗、免疫检查点抑制剂和针对驱动突变（如EGFR、ALK、ROS1）的靶向药物等先进疗法已显示出一定的治疗效果，但晚期NSCLC患者的5年生存率仍然低于20%。这种 dismal 预后主要源于两个相互交织的生物学挑战：内在的凋亡抵抗和早期转移扩散。其中，B细胞淋巴瘤-2（BCL-2）家族蛋白的失调是凋亡逃避的核心机制，其过度表达会隔离促凋亡效应因子（如BAX/BAK），阻止线粒体外膜透化（MOMP）、细胞色素c（Cyt c）释放以及 caspase 级联反应的激活。临床上，BCL-2的过度表达与化疗耐药和肿瘤复发密切相关，导致NSCLC患者预后不良。然而，直接的药理抑制剂如venetoclax由于骨髓细胞白血病-1（MCL-1）的代偿性上调以及血小板上的 on-target 毒性而疗效有限。

与此同时，分子治疗剂，特别是使用小干扰RNA（siRNA）或功能性肽的RNA干扰（RNAi），其疗效受到“系统递送屏障”的严重阻碍。传统的纳米载体，如脂质纳米颗粒（LNPs）、介孔二氧化硅纳米颗粒（MSNs）和聚合物纳米颗粒，在NSCLC治疗中面临几个关键限制。例如，（i）被动靶向效率低：虽然增强的渗透性和保留效应（EPR）提供了适度的肿瘤积累，但缺乏足够的主动靶向配体会导致在肝/脾等脱靶器官中的分布和剂量限制性毒性；（ii）共递送能力不足：siRNA（带负电，约13 kDa）和膜破坏性肽（带正电，1-3 kDa）之间的物理化学差异阻碍了化学计量学的共负载，导致提前释放、有效载荷失衡和最终的协同作用丧失；（iii）内体/溶酶体滞留：超过95%的内化纳米载体在酸性内体/溶酶体中被降解，限制了不稳定的siRNA和肽的胞质生物利用度。

病毒样颗粒（VLPs）由病毒结构蛋白自组装而成，通过结合生物相容性、精确的结构控制和固有的细胞穿透能力，成为有前景的解决方案。HPV VLP主要来源于L1主要衣壳蛋白，具有 exceptional 稳定性、高有效载荷能力和可调的表面功能化。先前的研究利用VLP进行疫苗递送或siRNA单一疗法，但尚未设计出一个统一的平台，能够通过高亲和力肽实现肿瘤特异性主动靶向，或将siRNA和促凋亡肽共同封装在单个VLP结构中，更不用说协调的内体逃逸和双重亚细胞作用来克服凋亡抵抗。

为了弥补这一空白，研究人员设计了一种仿生纳米工程策略，将几种协同治疗作用整合到单个实体中，即siRNA_D-pep@VLP-SP5-2。该系统包含四个部分，每个部分具有特定功能。（1）SP5-2肽引导的肿瘤靶向：通过马来酰亚胺-硫醇化学在VLP表面修饰SP5-2（序列：TDSILRSYDWTY），克服了生物分布限制。（2）VLP介导的有效载荷保护：HPV L1衣壳（直径约53 nm）通过静电缩合封装siRNA，而D-肽（序列：KKLALALAKKWLALAKKLALALAKK）通过siRNA复合锚定，确保血清稳定性和两者的控制释放。（3）siRNA诱导的BCL-2沉默：BCL-2特异性siRNA（验证70%敲低）破坏BCL-2/BAX相互作用，使线粒体对透化敏感。（4）D-肽触发的线粒体凋亡：阳离子α-螺旋D-肽选择性破坏线粒体膜，诱导快速的线粒体膜电位（MMP）去极化（ΔΨ_m）、Cyt c释放和caspase-9激活，绕过上游BCL-2阻断。

这种多功能纳米组装体实现了三个变革性进展。（1）双重细胞内有效载荷激活：siRNA介导的基因沉默（细胞核/胞质）和D-肽驱动的线粒体透化的时空协调，通过协同凋亡诱导（组合指数CI < 1）验证。（2）分层靶向特异性：SP5-2使A549 NSCLC细胞的摄取比正常组织细胞（HEK293T）高5倍以上。通过将合成生物学与模块化纳米工程融合，该平台开创了“精准组合治疗”范式。它通过四维控制超越了传统的单一模式方法：靶向生物分布、共递送化学计量、亚细胞定位和协同机制。研究人员证明，协调RNA干扰与直接细胞器 destabilization 可以重塑NSCLC中的凋亡变阻器，从“靶点抑制”转向细胞死亡通路的“网络调控”。这项工作为基于VLP的 against 异质性实体瘤的诊疗一体化建立了多功能蓝图，对其他顽固性恶性肿瘤具有广泛适用性。

为开展本研究，研究人员运用了多项关键技术方法：通过大肠杆菌表达系统制备HPV 16 L1五聚体并自组装成VLP；采用静电驱动自组装优化siRNA与D-肽的P/N（磷/氮）摩尔比例（1:1.5）形成复合物；通过EDC/NHS介导的酰胺反应将靶向肽SP5-2共价连接至VLP表面；利用透射电子显微镜（TEM）表征纳米颗粒的形态和尺寸分布；通过Zeta电位测量分析表面电荷变化；采用荧光光谱法测定D-肽-FITC的包封效率；使用流式细胞术评估细胞摄取、凋亡率和线粒体膜电位；通过Western blot（WB）分析BCL-2和survivin蛋白表达水平；借助拉曼光谱检测线粒体细胞色素c释放；使用激光共聚焦显微镜观察内体逃逸效应；并建立在体A549荷瘤裸鼠模型进行体内靶向性和抗肿瘤功效评价。

3.1. 通过SP5-2偶联增强HPV-VLP的肿瘤靶向递送

通过荧光光谱验证了SP5-2与HPV-VLP的成功表面偶联。与未修饰的FITC-VLP相比，VLP-SP5-2-FITC在A549细胞中表现出显著增强的细胞摄取效率，2小时孵育后荧光强度提高5倍以上（p = 0.005）。在不同摩尔比（HPV L1 : SP5-2从1:1到1:8）的测试中，1:4的比例在A549细胞中达到饱和摄取，而在非靶向的HEK293T细胞中未观察到显著增加，证实了SP5-2对A549细胞的特异性结合。流式细胞术进一步证实了细胞类型特异性靶向，1:4摩尔比的VLP-SP5-2-FITC在1小时内在A549细胞中实现了63%的摄取，而FITC-VLP仅为6.9%。共聚焦显微镜观察显示，VLP-SP5-2 (1:4) 相比VLP具有更强的内体逃逸能力。

3.2. siRNA/D-pep双组装的合理设计与表征

通过琼脂糖凝胶阻滞实验优化了siRNA和D-肽（D-pep）之间的静电驱动组装。在P/N比（siRNA中磷原子与D-pep中氮原子的摩尔比）从1:0.75增加到1:1.5的过程中，观察到siRNA迁移逐渐延迟，在P/N = 1:1.5时达到饱和，此比例被确定为后续siRNA/D-pep组装的最佳条件。Zeta电位测量显示，裸露的siRNA表面电荷为-30.95 mV，阳离子D-pep为+10.29 mV，在最佳P/N比1:1.5时，siRNA_D-pep组装体的表面电位达到平衡（-6.4 ± 0.8 mV）。TEM图像显示siRNA-D-pep双组装体呈单分散性，均匀直径为12.6 ± 3.3 nm，明显小于HPV-VLP的内腔直径（30-35 nm），满足其被VLP结构高效封装的空间前提。

3.3. 四功能组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2的制备与表征

四功能组装体通过三步协议构建：首先在最佳P/N比1:1.5下预形成siRNA/D-pep核心；随后以0.5:1的质量比（siRNA : L1-p）与HPV L1-p衣壳蛋白共组装；最后通过碳二亚胺介导的酰胺偶联在表面功能化SP5-2配体。TEM分析显示形成了单分散球形组装体，平均直径为57.5 ± 9 nm，与空VLP（55.0 ± 7 nm）相比尺寸仅增加<5%，表明有效载荷封装没有引起显著结构变形。Zeta电位测量显示从siRNA_D-pep复合物的-6.4 ± 0.8 mV转变为最终四组装体的+2.7 ± 0.48 mV，证明了成功的VLP封装和SP5-2表面修饰。荧光定量分析表明，siRNA_D-pep-FITC在VLP-SP5-2保护腔中的包封效率达到69.7 ± 0.99%，而分离的BCL-2 siRNA组分的负载效率更高，达87.5 ± 3.31%。

3.4. 四功能组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2在NSCLC中的靶向凋亡诱导

使用Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞术进行的凋亡分析揭示了A549细胞中不同的凋亡诱导模式。单独的D-肽诱导了显著的凋亡（50.8 ± 1.3%），而siRNA_D-pep组装体使其略微增加至55 ± 2.4%。VLP和D-肽的物理混合物将凋亡进一步增强至61.3 ± 2.1%。相比之下，缺少D-肽的siRNA基组装体凋亡诱导能力显著降低，siRNA@VLP仅诱导10.6 ± 0.5%的凋亡，siRNA@VLP-SP5-2也仅达到19.3 ± 0.9%。值得注意的是，三组装体siRNA_D-pep@VLP显示出81.0 ± 0.4%的凋亡诱导率，而四组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2实现了最高的凋亡率91.2 ± 1.5%。使用Chou-Talalay模型进行的协同相互作用分析显示，所有组合指数（CI）均小于1，为这两种组分的协同作用提供了强有力的统计证据。对照实验证实了A549细胞的选择性反应，在HeLa和HEK293T细胞中未观察到显著差异。

3.5. siRNA_D-pep@VLP-SP5-2组装体对癌细胞的凋亡机制

3.5.1. A549细胞中BCL-2表达水平

Western blot（WB）分析定量评估了siRNA在A549细胞中介导的BCL-2表达抑制效率。与对照组相比，D-pep处理仅引起BCL-2表达的边际（3%）减少，siRNA_D-pep也仅轻微降低（B/T = 0.908）。相比之下，siRNA_D-pep@VLP处理显著降低了B/T比38%（0.616 vs 对照），而siRNA_D-pep@VLP-SP5-2组装体实现了最显著的抑制，将B/T比降低至0.45（较对照减少55%）。为了分离SP5-2对siRNA递送的具体贡献，在排除D-pep的情况下评估了三种不同组装体：裸露siRNA、siRNA@VLP和siRNA@VLP-SP5-2对BCL-2沉默水平的影响。结果显示，siRNA@VLP-SP5-2组实现了对BCL-2表达的最显著抑制（B/T比 = 0.449），提供了SP5-2功能化显著增强VLP靶向特异性和siRNA递送效率的有力证据。

3.5.2. 增强线粒体膜破坏和细胞色素c释放

采用线粒体膜电位（MMP）测定作为线粒体功能障碍的敏感指标。用游离siRNA_D-pep、siRNA_D-pep@VLP或siRNA_D-pep@VLP-SP5-2处理A549细胞3、6和12小时后，使用MitoTracker Deep Red（MTDR）定量分析MMP。与游离siRNA_D-pep相比，siRNA_D-pep@VLP的增强性能凸显了VLP封装在提高细胞摄取效率和保护siRNA免遭降解方面的关键作用。此外，四组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2相比三组装体更优越的线粒体破坏效应，强调了SP5-2介导的肿瘤靶向的附加价值，它不仅增强了细胞内化，还增强了线粒体破坏，导致更有效的凋亡诱导。采用拉曼光谱监测线粒体细胞色素c（Cyt c）释放。经过12小时处理后，观察到所有实验组中线粒体Cyt c信号逐渐减少，表明剂量依赖性的Cyt c从线粒体释放到胞质中。四组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2表现出最显著的效果，将线粒体中的Cyt c信号减弱到几乎检测不到的水平。

3.5.3. 四功能组装体增强caspase-3激活

Caspase-3是凋亡级联中的核心执行者蛋白酶。为了准确量化caspase-3激活，用三种不同组装体处理A549细胞特定时间间隔（3、6和12小时），然后使用高灵敏度的GreenNuc? Caspase-3 Substrate通过流式细胞术评估细胞反应。结果表明，与游离siRNA_D-pep处理相比，siRNA_D-pep@VLP组装体引起显著更强的caspase-3激活，凸显了VLP介导的递送在增强凋亡信号效率方面的关键作用。最值得注意的是，创新的四组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2表现出最显著的caspase-3活性和最快的诱导动力学。

3.5.4. 四功能组装体对A549细胞中survivin表达的调控

Survivin是凋亡蛋白抑制剂（IAP）家族的关键成员。为了更深入了解四组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2的凋亡机制，系统评估了其对A549肺腺癌细胞中survivin表达的影响。有趣的是，单独的游离D-pep、siRNA_D-pep或siRNA@VLP处理对survivin水平的影响极小。相比之下，多功能组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2、siRNA_D-pep@VLP和siRNA_D-pep@HmA demonstrated 对survivin的 robust 下调。关键的是，siRNA_D-pep@VLP-SP5-2组装体相比三组装体siRNA_D-pep@VLP显示出显著更优的survivin抑制功效。这种增强的 suppression 与survivin作为caspase-3直接底物的既定功能直接相关。

3.6. 组装体的体内抗肿瘤功效

为了评估siRNA_D-pep@VLP-SP5-2组装体的治疗潜力，建立了A549荷瘤裸鼠模型。将小鼠随机分为四组（n = 4），分别用PBS（对照）、游离siRNA_D-pep、siRNA_D-pep@VLP或siRNA_D-pep@VLP-SP5-2处理。肿瘤生长随时间监测，关键发现包括：（1）肿瘤生长抑制：siRNA_D-pep双组装体显示出中等的抗肿瘤效果，较PBS对照组减少38.5%的肿瘤生长。siRNA_D-pep@VLP组装体表现出增强的肿瘤抑制（49.25%抑制）。最引人注目的是，siRNA_D-pep@VLP-SP5-2组装体实现了最高的肿瘤生长抑制率（78.2%）。（2）组装体的生物安全性：综合系统毒性评估显示，治疗期间任何实验组的体重均无显著变化。主要器官（肾、肺、脾、肝、心）的H&E染色显示无明显病理损伤。（3）肿瘤质量分析：从siRNA_D-pep@VLP-SP5-2治疗组切除的肿瘤表现出明显减小的尺寸和重量。（4）体内靶向：Cy5标记组装体的荧光成像揭示了 distinct 生物分布模式。SP5-2修饰的siRNA_D-pep@VLP-SP5-2表现出明显的肿瘤特异性积累，而未修饰的siRNA_D-pep@VLP-CY5显示弥散分布，仅部分肿瘤摄取。

本研究成功设计了一种基于HPV VLP的四功能组装体siRNA_D-pep@VLP-SP5-2，它协同了肿瘤靶向递送、基因沉默能力、肽诱导凋亡和大幅改善的细胞进入，以克服非小细胞肺癌（NSCLC）中的治疗抵抗。实现的关键进展包括：（i）靶向精准性：将NSCLC特异性SP5-2肽偶联到VLP表面增强了肿瘤选择性和细胞摄取。（ii）共递送效率：封装自组装的siRNA_D-pep能够同时递送靶向BCL-2的siRNA和具有线粒体破坏活性的阳离子D-肽。（iii）强效治疗作用：四功能设计在体外实现了70%的BCL-2敲低，近乎完全的凋亡诱导（91%），并在小鼠模型中抑制了78.2%的肿瘤生长，超越了传统方法且无系统毒性。（iv）深入的动力学研究：系统地揭示了siRNA沉默BCL-2表达、D-肽增强线粒体膜破坏和Cyt c释放，以及它们协同增强caspase-3激活和survivin下调的过程，这将加速其走向临床应用。因此，这项工作开创了一种模块化VLP策略，桥接了RNAi治疗和肽介导的细胞毒性，为肿瘤学中的精准共递送提供了蓝图。该组装体的多功能性，适用于表面修饰和有效载荷定制，使其成为解决NSCLC中多种耐药机制的变革性工具。未来的研究将探索其在其他致癌靶点和联合疗法中的适用性，加速其向临床转化的道路。该研究发表于《Materials》期刊，为癌症治疗领域提供了新的思路和方法。