一种由pH值触发的抗氧化干细胞球状体平台能够恢复旁分泌信号传导，从而促进骨质疏松症的骨再生

《Materials Today Advances》：A pH-triggered antioxidative stem cell spheroid platform restores paracrine signaling to enhance osteoporotic bone regeneration

本研究设计了一种基于微流控技术的pH响应性干细胞递送系统，通过将槲皮素负载的脂体与GelMA水凝胶微球结合，并修饰pH响应外壳，有效改善骨髓间充质干细胞（BMSCs）的存活率、成骨分化能力和旁分泌功能。体外实验显示该系统显著促进矿化结节形成及RUNX2、COL-1、SP7等成骨相关基因表达，并增强VEGFA等促血管生成因子分泌。体内研究表明，该系统能加速骨缺损修复，改善骨结构重建。分子机制分析表明其通过激活钙信号、AMPK及PPAR等通路协同调控骨再生。该策略为骨质疏松骨修复提供了新型细胞治疗平台。

　　### 研究背景与意义

在骨质疏松性骨缺损的治疗领域，骨髓间充质干细胞（BMSCs）因其在组织再生中的关键作用而受到广泛关注。BMSCs不仅具备强大的成骨分化能力，还能通过旁分泌信号调控局部微环境，影响血管生成、免疫稳态和内源性修复机制。然而，当前传统的治疗方法，如骨移植或材料填充物，虽然能够提供暂时的机械支撑，却难以有效调节再生微环境并恢复功能性的组织结构。因此，开发一种能够有效增强BMSCs功能、改善其存活率与归巢效率的新型递送系统成为亟需解决的问题。

近年来，干细胞工程与生物材料科学的结合为解决这一问题提供了新的思路。其中，水凝胶微球因其良好的生物相容性、类组织机械性能以及可调控的结构特性，被广泛应用于细胞递送系统。尤其是基于微流控技术制造的水凝胶微球，因其尺寸均匀、结构可控、负载能力优异，被认为是下一代干细胞递送平台的重要候选材料。此外，研究还发现，骨质疏松症等病理状态下，细胞所处的微环境往往受到氧化应激的影响，导致活性氧（ROS）水平升高、线粒体功能受损以及信号传导异常，从而严重削弱BMSCs的成骨分化能力与旁分泌功能。因此，如何在骨缺损部位构建一个能够抵抗氧化应激、支持BMSCs长期存活并维持其功能的微环境，成为提高治疗效果的关键。

基于此，本研究提出了一种融合抗氧化功能与微环境调控的新型干细胞递送平台。该平台利用微流控技术构建了具有三维多孔结构的水凝胶微球，内部封装了能够持续释放的白藜芦醇负载脂质体。白藜芦醇作为一种天然的多酚类抗氧化剂，具有清除自由基、保护线粒体完整性以及调控信号通路的多重功能，但其在体内的生物利用度较低，代谢迅速，难以实现持续的治疗效果。为此，研究团队通过设计一个能够实现局部蓄积与可控释放的递送系统，解决了这一问题。此外，该平台还引入了pH响应性壳层，利用水凝胶表面的醛基与GelMA中的氨基通过席夫碱反应形成交联结构，从而在酸性微环境中实现响应性释放。这种设计不仅提升了微球的结构稳定性，还为细胞提供了一个更接近体内自然环境的支架，促进了BMSCs的存活、分化和功能维持。

### 材料与方法

本研究首先通过薄层水化法合成白藜芦醇负载脂质体（R-lip）。具体而言，将卵磷脂与胆固醇溶解于氯仿与甲醇混合溶剂中，随后加入白藜芦醇，通过减压蒸发形成均匀的脂质膜，再加入磷酸盐缓冲液（PBS）并超声处理，最终获得稳定的脂质体分散液。通过三重过滤处理，确保脂质体的尺寸均匀，避免聚集。实验结果显示，空白脂质体（Lip）的平均粒径约为153纳米，而负载白藜芦醇的脂质体（R-lip）粒径略有增加，达到约167纳米，但两者在统计学上无显著差异，表明白藜芦醇的封装并未影响脂质体的结构稳定性。

接下来，研究团队利用甲基丙烯酸酐对明胶进行化学修饰，合成具有甲基丙烯酸基团的GelMA单体。该单体随后被用于构建水凝胶微球，同时引入了具有醛基的透明质酸（HA-CHO），通过席夫碱反应形成pH响应性壳层。通过微流控技术，将含有R-lip的GelMA溶液与矿物油-Span 80混合物分别作为水相与油相，生成稳定的水包油乳滴，并通过紫外光照射实现光交联，形成最终的GelMA@liposome水凝胶微球。随后，通过乙醚与PBS多次洗涤去除未反应的HA-CHO，最终获得具有pH响应性的复合微球（G-RLip）。

为了验证微球的理化性质，研究团队采用动态光散射（DLS）技术测定其粒径分布，通过核磁共振（NMR）分析其化学结构，并利用扫描电子显微镜（SEM）观察其表面形貌与多孔结构。此外，通过能量色散X射线光谱（EDS）分析微球中的元素组成，进一步确认脂质体的均匀分布与有效封装。这些材料表征结果表明，所构建的G-RLip微球具备良好的结构稳定性、可控的释放特性以及适宜的细胞生长环境，为后续的生物学实验奠定了基础。

在细胞实验方面，研究团队首先对BMSCs进行了体外培养与成骨诱导实验。BMSCs来源于3周龄大鼠的股骨骨髓，培养基中添加了β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松等成骨诱导因子。在成骨诱导过程中，采用碱性磷酸酶（ALP）染色、茜素红S（ARS）染色、免疫荧光和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等方法评估细胞的成骨分化能力。结果显示，G-RLip与GB-RLip微球均能显著促进ALP活性和钙沉积，其中GB-RLip表现出更优的成骨诱导效果，特别是在COL-1和OCN的表达水平上，其上调幅度显著高于对照组。

为了进一步评估微球对细胞迁移与血管生成的影响，研究团队进行了体外细胞迁移实验、划痕愈合实验和管形成实验。实验结果显示，GB-RLip微球显著增强了人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移能力，特别是在24小时的Transwell迁移实验中，GB-RLip组的迁移细胞数达到379个，远高于对照组和G-RLip组。此外，在划痕愈合实验中，GB-RLip组在12小时内实现了高达81.37%的伤口闭合率，表明其在促进细胞迁移和组织修复方面具有显著优势。而在管形成实验中，GB-RLip组形成了更为密集和结构完整的血管样网络，其总管长度和分支数量分别达到49.29×103和1625个，进一步验证了其促血管生成的能力。

为了探讨GB-RLip对氧化应激的调控作用，研究团队还进行了氧化应激相关基因的表达分析。结果显示，GB-RLip组的NRF2和HO-1基因表达水平显著高于对照组和G-RLip组，表明该材料能够有效激活细胞的内源性抗氧化防御系统。此外，通过ELISA检测，研究团队发现GB-RLip组的BMSCs分泌的VEGFA水平显著升高，进一步支持了其促血管生成的功能。这些结果表明，GB-RLip不仅能够通过物理支架促进细胞存活与分化，还能通过其内在的抗氧化与促血管生成功能，为骨质疏松性骨缺损的修复提供了全面的微环境支持。

### 体内实验与效果评估

为了验证GB-RLip在体内修复骨质疏松性骨缺损的效果，研究团队建立了大鼠股骨缺损模型，并将材料植入缺损部位，随后通过微CT成像和多种组织学分析评估其修复效果。结果显示，在植入GB-RLip后，4周和8周的微CT图像显示，对照组仅表现出轻微的骨再生迹象，而GB-RLip组则实现了缺损区域的几乎完全填充，呈现出致密的骨小梁结构和结构整合的骨组织，特别是在8周时，骨重建效果最为显著。相比之下，G-RLip组虽然也显示出一定的骨再生能力，但其效果远不如GB-RLip组。

组织学分析进一步支持了这一结论。H&E染色和Masson三色染色结果显示，GB-RLip组的缺损区域出现了大量新生骨组织和丰富的胶原沉积，而对照组则几乎未见明显的新生骨形成，仅在微结构上表现出轻微的变化。此外，免疫荧光分析表明，GB-RLip组在骨组织中OCT和VEGFA的表达水平显著高于其他组，尤其是在8周时，这种表达增强更为明显。这些结果表明，GB-RLip不仅能够促进骨组织的再生，还能通过增强血管生成能力，为新生骨组织提供必要的营养支持和氧气供应。

为了深入理解GB-RLip在体内调控骨再生的分子机制，研究团队进行了转录组测序分析。通过对不同处理组的BMSCs进行基因表达分析，研究团队发现，GB-RLip显著上调了与成骨分化和血管生成相关的多个信号通路，包括钙信号通路、AMPK信号通路、肌细胞骨架组织和PPAR信号通路。这些通路的激活表明，GB-RLip能够通过多重信号轴的协同作用，构建一个促再生的微环境，从而实现对骨组织修复的全面调控。

### 研究成果与创新点

本研究的核心创新在于设计了一种集抗氧化功能、结构支持与微环境调控于一体的多功能微球递送平台。该平台通过微流控技术实现精准的脂质体封装，并利用pH响应性壳层实现对白藜芦醇的可控释放。这种设计不仅提升了微球的生物相容性，还通过维持BMSCs的抗氧化能力与旁分泌功能，显著增强了其在骨缺损部位的存活率和分化能力。此外，该平台还通过调控免疫微环境，促进巨噬细胞向抗炎、修复型M2表型极化，进一步优化了局部微环境，为骨再生提供了额外的促进因素。

在体内实验中，GB-RLip表现出显著的骨再生能力，能够有效填充缺损区域，形成结构完整的骨组织。这种性能的实现得益于其多孔结构，不仅促进了细胞的附着与迁移，还为细胞提供了充足的营养和氧气供应。此外，GB-RLip的抗氧化功能有效缓解了骨缺损部位的氧化应激，为细胞的长期存活提供了保障。同时，其促血管生成能力显著提高了局部微环境的血液供应，进一步支持了骨组织的再生过程。

### 潜在应用与未来展望

本研究提出的GB-RLip平台不仅在体外实验中表现出优异的细胞相容性与促成骨能力，还在体内实验中验证了其在骨质疏松性骨缺损修复中的有效性。这一成果为干细胞疗法在骨再生领域的应用提供了新的思路，特别是在如何提升干细胞在体内的存活率与功能维持方面。此外，该平台的设计策略也为智能生物材料的发展提供了参考，特别是在如何通过响应性材料实现对病理微环境的精准调控方面。

从临床应用的角度来看，GB-RLip平台的微创性与可注射性使其适用于复杂形状的骨缺损修复，具有广阔的前景。未来，该平台可进一步优化，以提高其在不同病理条件下的适用性。例如，可以探索在不同类型的骨缺损（如骨癌或骨折后骨不连）中的应用，或结合其他生物活性分子，以实现更全面的微环境调控。此外，该平台还可以与其他生物材料（如可降解支架或生物活性因子）结合，以进一步提升其修复效果。

总的来说，本研究通过整合抗氧化、结构支持与微环境调控，构建了一个能够有效促进骨质疏松性骨缺损修复的多功能干细胞递送平台。这一策略不仅提升了干细胞的治疗效果，还为未来智能生物材料的设计与应用提供了新的方向。随着生物医学工程的不断发展，此类多功能材料有望成为骨再生治疗领域的重要工具，为临床提供更安全、高效的治疗方案。