利用多重RT-PCR实现小鼠单克隆抗体的同步同种型鉴定与互补决定区分析

本文开发了一种集成化分子表征策略，通过设计含通用适配序列的多重反转录引物（Multiplex-RT），无需预先获知抗体同种型即可合成cDNA，并结合同种型特异性PCR（Iso-PCR）同步鉴定小鼠单抗的同种型、IgG亚类与互补决定区（CDR）序列，为抗体工程与重组生产提供高效技术路径。

Highlight

高效同种型非依赖型cDNA合成由多重RT引物实现

为建立可靠的小鼠免疫球蛋白可变区扩增方法，我们首先从IMGT数据库收集重链与轻链同种型序列，通过多序列比对寻找适用于通用引物的保守区域。然而不同同种型间序列分化程度过高，无法跨所有类别找到单一保守区（图S1），因此无法设计出覆盖全部同种型的单一通用引物。

讨论

既往基于PCR的抗体可变区测序策略在设计通用引物方面面临困难。采用针对5′端区域的简并引物替代方案成功率仅80–90%，主要归因于非特异性引物结合或扩增失败[[23], [24], [25], [26]]。依赖5′ RACE（快速扩增cDNA末端）的方法需经历mRNA加尾、cDNA纯化等多步骤，操作繁琐且成功率有限。

细胞培养与转染

自制杂交瘤细胞系通过脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞系（ATCC #CRL-1581）融合制备[[37]]。脾细胞取自经合成肽或重组蛋白免疫的小鼠：小鼠MLC1（克隆37E5）与小鼠SHLP2（克隆5E3）的合成肽；人TREM2（克隆T3A11C2）与人Lcn2（克隆3F1）的重组蛋白。IVA12杂交瘤（HB-145）购自ATCC。杂交瘤细胞用Hybridoma-SFM培养基培养。

生成式AI与AI辅助技术使用声明

论文撰写过程中，作者使用ChatGPT5进行语法检查。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审阅与编辑，并对已发表文章的内容承担全部责任。

CRediT作者贡献声明

Junmo Hwang: 撰写初稿，概念化，研究实施，数据整理，验证，形式分析。Eunbi Kim: 审阅编辑，研究实施，数据整理，验证。Jina Kim: 审阅编辑，研究实施，数据整理，验证。Sujin Shin: 审阅编辑，研究实施，数据整理，验证。Hyun-Ho Lim: 撰写初稿，审阅编辑，概念化，资源提供，监督指导，项目管理。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成潜在利益冲突的财务/个人关系：Hyun-Ho Lim拥有已授权专利#KR-10–2156165（权属：DGIST、ASAN基金会与蔚山大学），及申请中专利#KR-10–2023-0029962（权属：DGIST）。Junmo Hwang拥有申请中专利#KR-10–2023-0029962（权属：DGIST）。Hyun-Ho Lim与Junmo Hwang共同拥有申请中专利#KR-10–2025-0070978（权属：DGIST）。鉴于其编辑角色，作者承诺透明处理。

致谢

本研究受韩国脑研究院（KBRI）基础研究计划（编号25-BR-01-02与25-BR-05-07至H.H.Lim）与ELA国际（编号ELA no.2024-01814至H.H.Lim）资助。感谢Lim实验室全体成员在研究过程中提供的及时帮助。