基于逆转录多酶等温快速扩增（RT-MIRA）的手持式仙台病毒现场可视化检测系统的开发与应用

《Microbial Pathogenesis》：An on-site detection assay for screening of sendai virus by using palm-sized handheld system based on the reverse transcription multienzyme isothermal rapid amplification

本研究开发了一种基于逆转录多酶等温快速扩增（RT-MIRA）技术的手持式现场检测系统，用于快速、高灵敏、高特异地筛查仙台病毒（SV）。该系统在39°C等温条件下20分钟即可完成扩增，检测限达33.5 copies/μL，并与RT-PCR方法高度一致（Kappa=0.949），为实验室动物的现场病原监测提供了高效解决方案。

　　

Highlight

标准质粒的构建

SV L基因（642 bp，参考序列GenBank: NC_001552.1, 9736-10377nt）和M基因（287 bp，GenBank: AF001284.1, 761-1047nt）的DNA片段经化学合成后，被克隆至pUC57载体中，并通过Sanger测序验证。SV标准质粒构建成功。在常规啮齿类动物设施中，慢性感染普遍存在，常涉及小鼠微小病毒（MVM）、鼠痘病毒等病毒。

现场RT-MIRA检测流程与原理

为建立用于SV检测的现场RT-MIRA assay，我们首先选择了最保守的L基因（图1A）。带有FAM标记探针的RT-MIRA反应可利用手持式数字恒温设备进行可视化观察。SV现场检测的工作流程如图1B所述。在我们的检测中，开发了核酸快速释放剂以进一步缩短实验时长。该核酸释放试剂可应用于快速核酸提取。

讨论

实验动物的外源性感染是导致疾病和病理（如肺炎和脓肿）的原因。即使亚临床感染影响了低影响的实验程序，仙台病毒本身也可在没有其他重要病原体的情况下，在实验室大鼠中诱发严重（虽然是短暂的）鼻炎和肺炎。此外，与啮齿动物不同，家兔对SV不敏感。检测到53%的家兔存在仙台病毒抗体，表明这些病毒感染的普遍性。

结论

本研究介绍了一种新型扩增技术，并描述了一种简便高效的用于SV检测的RT-MIRA assay。该检测提供了一个易于使用的平台，可对在实验室环境和啮齿动物中传播的SV感染进行简单的现场分析。