EN-MARK研究：三线T-DXd疗效与HER2动态变化的开创性探索

本推荐聚焦前瞻性EN-MARK研究，旨在探索HER2阳性胃食管腺癌（GEA）患者一线曲妥珠单抗（T-mab）治疗后生物标志物（包括HER2状态）的动态变化与三线曲妥珠单抗德鲁替康（T-DXd）疗效的关联。研究通过多时间点组织与血液活检，首次系统评估HER2表达丢失现象及ctDNA（循环肿瘤DNA）、HER2 ECD（细胞外结构域）的预测价值，为T-DXd的精准应用与液体活检策略提供关键证据。

　　

Highlights

研究重点揭示：一线曲妥珠单抗（T-mab）治疗后HER2表达丢失现象并不罕见。该研究作为首个前瞻性项目，系统评估多线治疗过程中肿瘤组织与血液样本的HER2动态变化。三线曲妥珠单抗德鲁替康（T-DXd）疗效与生物标志物（包括HER2状态）动态变化的相关性尚待明确。研究成果有望指导基于生物标志物的T-DXd治疗策略与时机选择，并凸显液体活检的重要作用。研究将生成独特的HER2表达与基因组改变的纵向数据集，以阐明治疗反应与耐药机制。

Abstract

Background

人表皮生长因子受体2（HER2）在约20%的晚期胃食管腺癌（GEA）中过表达。曲妥珠单抗（T-mab）是HER2阳性GEA的标准一线治疗，而曲妥珠单抗德鲁替康（T-DXd）在后线治疗中展现出临床疗效。然而，T-mab治疗后HER2表达的潜在丢失引发了对T-DXd后续疗效的担忧。跨治疗线HER2表达的时序动态变化尚未被充分理解。

Design

研究者设计了一项前瞻性、单臂、多中心研究，旨在探究HER2阳性GEA患者一线T-mab治疗后，三线T-DXd疗效与肿瘤组织及血液中HER2状态变化之间的关联。目标是指导T-DXd的最佳临床应用。在一线治疗后的每个治疗线，将进行系列肿瘤和/或血液再活检。研究分为两部分。第一部分将评估二线治疗期间生物标志物的动态变化——特别是HER2状态和循环肿瘤DNA（ctDNA）改变。第二部分将评估三线T-DXd相对于这些生物标志物变化的疗效和安全性。约120名患者将参与第一部分，50名患者参与第二部分。

Graphical abstract

研究图示摘要阐释了三线HER2靶向治疗在一线抗HER2曲妥珠单抗治疗后的生物学原理。基于肿瘤内异质性和药物选择的克隆进化，二线治疗期间的HER2靶向治疗间歇期可能使HER2丢失的肿瘤恢复至HER2过表达且对HER2靶向药物敏感的状态。EN-MARK研究设计显示，约120名患者将招募参与第一部分（二线治疗），50名患者参与第二部分（三线T-DXd治疗）。研究涉及多个时间点的样本采集与评估，包括基线、治疗周期中及治疗结束时的影像学检查、肿瘤标志物（如HER2 ECD）检测、血液ctDNA分析以及可选的肿瘤组织采集。

Description OF protocol

Introduction

胃食管腺癌（GEA）是全球第五大常见癌症和第四大癌症相关死亡原因。人表皮生长因子受体2（HER2）是一种跨膜酪氨酸激酶受体，由位于17号染色体的ERBB2原癌基因编码。HER2的磷酸化启动促进细胞增殖、侵袭和存活的信号通路。约20%的晚期GEA患者表现出HER2过表达，这通常与基因扩增相关，HER2靶向药物已成为这些患者的个性化治疗方案。基于III期ToGA试验结果，人源化抗HER2单克隆抗体曲妥珠单抗（T-mab）联合化疗是首选的一线治疗方案。曲妥珠单抗德鲁替康（T-DXd）是一种HER2导向的抗体药物偶联物（ADC），由与T-mab氨基酸序列相同的人源化免疫球蛋白G1抗HER2单克隆抗体、基于四肽的可裂解连接子和强效拓扑异构酶I抑制剂有效载荷组成。在II期DESTINY-Gastric01试验中，与医生选择的化疗相比，T-DXd在既往接受过至少两种包括T-mab在内的姑息性全身治疗的HER2阳性GEA患者中，显示出客观缓解率（ORR）和总生存期（OS）的显著改善。作为唯一在三线治疗中显示出优于化疗方案结果的药物，T-DXd在日本被优先用于HER2阳性GEA的三线治疗。

值得注意的是，DESTINY-Gastric01试验的亚组分析显示，与HER2免疫组化（IHC）2+/原位杂交（ISH）+状态的患者相比，T-DXd在HER2 IHC 3+状态的患者中比医生选择的化疗更有效，表明T-DXd的抗肿瘤活性可能取决于HER2表达水平。类似地，据观察，T-DXd疗法的疗效因不同类型HER2表达实体瘤的HER2状态而异。此外，有报道称，在一线基于T-mab的化疗后，29%-69%的GEA患者出现HER2阳性丢失，引发了对T-DXd疗效减弱的担忧。因此，在二线T-DXd的临床试验中，要求通过再活检确认HER2阳性。同样，在三线T-DXd之前重新评估HER2状态可能有助于识别合适的候选者。然而，在II期DESTINY-Gastric01试验中，尽管大多数患者根据一线治疗前收集的存档肿瘤组织样本具有阳性HER2状态，T-DXd在三线或后线设置中仍显示出42.9%的高ORR。尽管继续使用T-mab的临床益处未在随机试验中得到证实，但在II期WJOG7112G（T-ACT）研究中，疾病进展后接受T-mab治疗的患者，若T-mab停药间隔较长，则显示出无进展生存期（PFS）和OS改善的趋势以及高ORR。ERBB2（HER2）基因平均拷贝数在T-mab停药间隔较长的患者中也高于间隔较短的患者。类似地，较长的二线治疗持续时间与三线T-DXd改善的生存期相关。基于这些发现，研究者假设，由于药物选择的克隆扩增而对HER2靶向治疗产生疾病进展的患者，在通过不含HER2靶向药物的二线化疗进行HER2信号阻断的特定间歇期后，可能会重新获得HER2表达和对HER2靶向治疗的敏感性。然而，目前尚无详细数据追踪一线治疗后HER2状态的连续动态变化，或评估三线T-DXd在HER2表达丢失患者中的治疗效果。

对许多患者而言，获取重复肿瘤活检样本具有挑战性，且因侵入性操作而带来医疗风险，特别是对于胃切除术后复发的GEA患者。鉴于肿瘤间和肿瘤内HER2异质性，基于组织的评估可能无法完全捕捉HER2状态。液体活检，包括循环肿瘤DNA（ctDNA）分析，可通过侵入性较小的程序部分解决肿瘤间和肿瘤内异质性带来的挑战。ctDNA也可作为基于组织的方法的替代方案，用于检测ERBB2（HER2）基因改变和预测GEA中T-mab的疗效，这为指导GEA患者的治疗决策提供了一种有前景的方法。HER2细胞外结构域（ECD）通过肿瘤表面的蛋白水解切割脱落进入循环，并可在血清中检测到。这种检测方法有潜力补充GEA中基于组织的HER2检测。测量血清HER2 ECD水平对于监测接受基于T-mab治疗的HER2阳性患者的临床结果具有临床实用性。DESTINY-Gastric01的事后分析发现，较高的基线HER2 ECD和血浆ERBB2（HER2）拷贝数与T-DXd的更大获益相关。DESTINY-CRC01试验中的类似结果支持HER2 ctDNA和ECD作为候选预测性生物标志物。

研究者设计了一项前瞻性、单臂、多中心研究，旨在通过在一线基于T-mab治疗后每个治疗线对肿瘤组织和/或血液进行重复活检，评估T-DXd疗效与生物标志物（包括HER2状态）动态变化之间的相关性。

Methods and analysis

Study objectives

本研究前瞻性调查HER2阳性GEA患者一线T-mab治疗后，通过每个治疗线的再活检，检测组织和血液样本中HER2状态的连续变化。目的是评估三线T-DXd疗法疗效与生物标志物动态变化之间的相关性，这些变化包括通过IHC/ISH评估的肿瘤HER2状态、ctDNA中的遗传改变以及HER2 ECD。

Study design and treatment

这项前瞻性、单臂、多中心研究包括两部分，将在日本约40个主要肿瘤中心招募患者。在第一部分，将招募约120名在一线含T-mab方案治疗期间或之后经历疾病进展的患者。我们将评估动态生物标志物变化，包括HER2状态和基因组谱的改变，并在标准二线治疗（如一线基于T-mab的化疗后的雷莫西尤单抗联合紫杉醇 therapy）期间收集临床数据。用于ctDNA分析的血液样本将在二线治疗开始前和治疗结束时收集。HER2 ECD将作为肿瘤标志物每月测量一次。对于每个部分中同意活检的合格患者，将在治疗开始前进行可选的肿瘤组织活检采样。

在第二部分，将招募50名参与第一部分、经历疾病进展或对治疗不耐受、并计划在三线治疗中接受T-DXd的患者。我们将研究三线T-DXd疗法疗效与动态生物标志物变化之间的相关性。T-DXd将每3周静脉注射一次，剂量为6.4 mg/kg体重，直至疾病进展、撤回同意或根据方案中止治疗。在出现临床显著或不可接受的毒性情况下，允许剂量中断、剂量减少和支持治疗。在第二部分最后一名患者注册日期后6个月，将收集生存信息。

所有潜在参与者将获得详细的研究信息和知情同意书。将分别获取参与第一部分和再次参与第二部分的同意，涵盖临床数据收集、系列血液和可选肿瘤采样以及剩余生物标本的二次使用。患者将从第一部分入组开始随访，直至第二部分最终注册后6个月。超过此期限的随访将针对与研究程序有可疑关系的未解决不良事件（AE）进行。

本研究于2023年12月21日经日本癌症研究基金会癌症研究所医院认证审查委员会批准（CRB3220003）。研究将根据《赫尔辛基宣言》（2013年福塔雷萨修订版）、《临床试验法》（2017年第16号法）、《临床试验法实施条例》（2018年厚生劳动省第17号令）、《个人信息保护法》（2003年第57号法）、相关法律法规、相关通知以及研究方案中阐述的伦理原则进行。重要的方案修改将传达至每个机构。该研究已在日本临床试验注册中心（jRCT）网站前瞻性注册（试验ID：jRCTs031240055）。注册期从2024年4月26日至2026年8月31日，研究期从jRCT发布日期至2028年8月31日。

Study population

eligibility criteria见Table 2。简要来说，患者必须年龄≥18岁，美国东部肿瘤协作组（ECOG）体力状态评分为0-2，具有足够的血液学和器官功能，并经组织学证实为不可切除或复发性HER2阳性GEA。

Endpoints

主要终点是研究者评估的第二部分中T-DXd的客观缓解率（ORR），定义为根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版达到完全或部分缓解的患者比例。治疗反应将通过计算机断层扫描或磁共振成像在基线和治疗期间每8周（±2周）评估一次，直至记录到疾病进展、撤回同意或达到中止标准。次要终点包括无进展生存期（PFS），定义为从开始T-DXd给药到疾病进展或任何原因死亡的时间（以先发生者为准）；治疗失败时间（TTF），定义为从开始T-DXd给药到因任何原因（包括疾病进展和死亡）中止治疗的时间；总生存期（OS），定义为从开始T-DXd给药到任何原因死亡的时间；以及根据常见不良事件评价标准（CTCAE）5.0版评估的第二部分中T-DXd的治疗毒性。不良事件（AE）将使用监管活动医学词典（MedDRA）进行编码，并计算严重AE的发生率和频率。将收集以下AE数据：第一部分中与研究特定程序有因果关系的AE（例如，肿瘤活检引起的出血或休克），以及第二部分中≥3级AE、所有级别的间质性肺疾病和与研究特定程序有因果关系的AE。

探索性分析包括基于患者背景信息和生物标志物动态变化的T-DXd疗效和安全性亚组分析，这些生物标志物包括通过IHC/ISH评估的肿瘤HER2状态、ctDNA中的遗传改变和HER2 ECD。将通过评估第一部分中相对大队列的组织和血液-based HER2状态的一致性，来评估侵入性较小的液体活检的临床效用。在第二部分中，研究将评估T-DXd治疗疗效与血液-based HER2状态之间的关联，进一步验证组织和血液评估之间的一致性。

Biomarker analysis

生物标志物分析将包括评估肿瘤和血液样本中HER2状态的一致性，以及评估生物标志物动态变化与T-DXd治疗疗效之间的相关性，这些生物标志物包括肿瘤HER2状态（IHC/ISH）、HER2 ECD和ctDNA中的ERBB2（HER2）扩增。血液样本将在预定时间点收集：二线治疗开始前和结束时（第一部分），以及T-DXd治疗第二周期第1天和治疗结束时（第二部分）。每个时间点将使用Streck无细胞DNA血液采集管抽取两管10毫升外周血。血液样本将送至中心实验室，使用Guardant360?进行ctDNA分析，这是一种经过临床实验室改进修正案（CLIA）认证、美国病理学家协会（CAP）认可、纽约州卫生部和FDA批准的临床下一代测序 assay，由Guardant Health开发。血清HER2 ECD水平将作为肿瘤标志物在第一部分和第二部分中每月在实施医疗机构或外包进行临床检测的公司测量一次。肿瘤HER2状态将使用HercepTest? mAb pharmDx进行IHC和PathVysion HER-2 DNA Probe Kit进行ISH集中评估，并遵循胃特异性HER2评分指南。用于HER2评估的组织活检是可选的。对于同意的患者，将收集至少三个肿瘤样本并进行福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）。活检将在二线（第一部分）和三线（第二部分）治疗开始前进行。如果一线治疗前获得的存档肿瘤组织样本数量充足，这些存档组织也将被提交。这些分析是探索性的。HER2 IHC/ISH或ctDNA检测的结果不会用于研究期间的临床决策，也不会向患者或治疗医生披露。

Data management

所有与研究相关的数据，包括患者特征、治疗细节、实验室结果、疗效结果、AE和剂量调整，将使用电子数据采集（EDC）系统收集。独立的数据中心将在分析前清理和锁定数据。本研究中的数据将遵循阿斯利康（AstraZeneca）和第一三共（Daiichi Sankyo）的数据共享政策获取。

Statistical considerations

Sample size

T-DXd的阈值ORR设定为15%，基于GEA三线纳武利尤单抗的真实世界结果。预期ORR设定为33%，反映了II期DESTINY-Gastric01试验和日本癌症研究基金会癌症研究所医院的真实世界数据。假设单侧α为0.05，效能（1?β）为90%，计算出第二部分需要50名患者。假设从第一部分到第二部分的转化率为65%，且70%的患者将构成反应可评估集（RES），为确保第二部分疗效评估有足够样本量的概率至少为80%，第一部分将总共招募120名患者。

Statistical analysis

疗效分析人群定义如下：用于主要终点分析的RES和用于次要终点分析的全分析集（FAS）。RES包括第二部分中根据RECIST v1.1具有可测量疾病且未被认定为不符合条件的患者。FAS包括所有注册患者，不包括第一部分中未接受标准二线方案（或注册后无数据）或第二部分中未接受T-DXd的患者。符合方案集（PPS）包括FAS中排除有重大方案违背或未接受研究治疗的患者后的子集。安全性分析集包括第一部分或第二部分中所有接受研究治疗的患者。将对主要分析人群总结患者特征，包括连续变量的汇总统计量和分类变量的计数和比例。对于主要终点，将计算第二部分RES的ORR及其95%置信区间（CI）。将进行二项检验，零假设为ORR <15%，备择假设为ORR ≥15%。将使用Kaplan-Meier法计算OS、PFS和TTF的中位持续时间及其95% CI。对于OS，还将估计6个月时的生存率。

Monitoring

为确保研究根据研究方案安全进行和数据的准确收集，将进行定期监查。主要研究者和监查员将确认研究已根据研究方案和相关通知进行。将根据研究相关记录和通过EDC收集的数据监查研究计划。

Discussion

III期DESTINY-Gastric04试验最近证明，在HER2阳性转移性GEA患者中，与雷莫西尤单抗联合紫杉醇作为二线治疗相比，T-DXd显著延长了OS（中位14.7个月 versus 11.4个月，风险比0.70，P = 0.004）。T-DXd还改善了PFS和ORR，支持T-DXd作为首选二线治疗。重要的是，鉴于T-mab-based治疗后HER2丢失的高频率，合格患者要求基于一线T-mab-based therapy疾病进展后进行的肿瘤活检确认HER2阳性GEA。因此，对于肿瘤已丢失HER2表达或无法进行组织再活检以重新评估HER2状态的患者，二线T-DXd的疗效仍不清楚。

这是首个前瞻性研究，系统评估一线T-mab-based therapy后肿瘤组织和血液样本中的HER2状态，并将这些动态生物标志物变化与HER2阳性GEA中三线T-DXd疗效相关联。本研究将生成来自相同患者的跨多治疗线的HER2表达、基因组改变和血清HER2 ECD水平的纵向数据集。将这些数据与临床结果相关联，将为T-DXd的最佳时机和患者选择提供机制性见解。它还可能阐明三线T-DXd therapy在一线T-mab-based therapy后肿瘤转化为HER2阴性状态患者中的疗效。重要的是，该研究还探索了基于血液的检测方法（包括ctDNA和HER2 ECD）用于监测HER2状态的可行性和临床效用。通过比较大队列中肿瘤组织和血液样本的生物标志物状态，本研究将有助于确定基于血液的HER2评估是否可以指导临床决策，特别是在肿瘤再活检禁忌或不切实际的患者中。如果血液生物标志物（如ctDNA检测到的ERBB2（HER2）扩增或升高的HER2 ECD水平）被证明与T-DXd疗效相关，未来的临床工作流程可能会整合这些微创检测方法，以优化患者选择并避免因肿瘤异质性而错失治疗机会。基于组织和基于血液的HER2结果之间的不一致可能源于肿瘤异质性、采样限制或 assay 敏感性的差异。在本研究中，我们将通过进行探索性分析来评估根据每个生物标志物来源的临床结果，以解决不一致的案例。此外，我们将探索不一致案例的具体特征，包括变异等位基因频率、转移部位和肿瘤负荷，以更好地描述一致性或不一致性的生物学基础。该分析框架将为液体活检在现实世界决策中的整合提供具有临床意义的见解。此外，基于血液的基因组分析可能揭示对T-DXd的内在或获得性耐药机制，并为下一代HER2靶向策略的开发提供信息。鉴于HER2是一个有吸引力的靶点分子，这些发现对于HER2靶向治疗的未来发展也将具有价值。

研究的局限性包括其单臂设计，缺乏对照组，使得难以评估内部有效性。

其他局限性包括专注于单一地理区域，可能限制研究结果的普适性。然而，HER2丢失现象在不同种族群体中被报道为基本一致。此外，胃癌中HER2靶向治疗的关键试验，包括ToGA和DESTINY-Gastric04，已在亚洲和非亚裔亚组中证明了治疗益处。在此基础上，我们预计关于HER2动力学及其与曲妥珠单抗德鲁替康疗效关联的机制性见解将具有广泛的适用性。尽管如此，跨种族和区域人群的肿瘤生物学和后续治疗可用性的差异可能会影响结果。此外，考虑到本研究的探索性质，需要进一步的研究，包括涉及非日本人群的队列，来验证结果。

Conclusion

这项研究是首个前瞻性研究，在一线T-mab-based therapy后对同一患者的肿瘤组织和血液样本进行HER2状态的连续评估，为指导T-DXd在临床实践中的最佳利用提供了额外见解。

Acknowledgements

我们深深感谢参与本研究的患者及其家属，以及各参与中心的所有研究团队。

Funding

本研究由第一三共（Daiichi Sankyo）赞助。2019年3月，阿斯利康（AstraZeneca）与第一三共就T-DXd达成了全球开发和商业化合作协议。第一三共将为这项研究的进行提供必要的资金；研究方案、数据管理计划和统计分析计划的制定；以及安全信息的收集和总结报告。

Disclosure

作者披露了与多家制药公司的利益关系，包括演讲酬金、咨询角色、荣誉和研究资助，具体涉及百时美施贵宝、小野药品、第一三共、安斯泰来、武田药品等公司。部分作者是第一三共的现任员工。所有其他作者声明无利益冲突。