TCEB2通过招募NEDD4介导Slit2泛素化降解促进三阴性乳腺癌中M2型巨噬细胞极化的机制研究

本研究针对三阴性乳腺癌(TNBC)免疫抑制微环境中M2型肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)浸润导致预后差的临床难题，揭示了转录延伸因子TCEB2通过招募E3泛素连接酶NEDD4介导Slit2蛋白K63泛素化降解的新机制。研究人员发现TCEB2沉默可显著抑制TNBC细胞增殖侵袭并逆转M2极化，而外源性Slit2处理可促进M1型极化特征。该研究为TNBC免疫靶向治疗提供了新的理论依据和治疗靶点。

　　

在乳腺癌的众多亚型中，三阴性乳腺癌(TNBC)因其缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)表达，成为临床治疗中最棘手的类型。这类肿瘤不仅具有高度侵袭性和转移性，更因其免疫抑制微环境而导致化疗耐药和预后不佳。近年来，肿瘤微环境(TME)中的免疫细胞，特别是肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的作用日益受到关注。这些巨噬细胞在肿瘤微环境中可极化为具有抗肿瘤作用的M1型或促肿瘤作用的M2型，其中M2型巨噬细胞通过分泌多种细胞因子促进肿瘤血管生成、免疫逃逸和远处转移。

然而，TNBC细胞如何调控巨噬细胞极化的分子机制尚不明确。以往研究表明，Slit2作为一种分泌性蛋白，在多种恶性肿瘤中发挥肿瘤抑制作用，其可通过激活M1型巨噬细胞抑制乳腺癌转移。但Slit2在TNBC中的表达调控机制及其对巨噬细胞极化的影响仍有待阐明。与此同时，转录延伸因子TCEB2（又称Elongin B）作为E3泛素连接酶复合体的核心组分，在多种肿瘤中参与蛋白泛素化降解过程，但其在TNBC免疫微环境调控中的作用从未被报道。

为解答这些科学问题，研究人员在《Translational Oncology》上发表了最新研究成果。该研究首先收集了40对TNBC组织及癌旁正常组织，并纳入40例非TNBC乳腺癌组织作为对照。通过qRT-PCR、Western blot等技术检测基因和蛋白表达水平，使用CCK8、集落形成、划痕愈合和Transwell实验评估细胞恶性行为，采用ELISA检测细胞因子分泌水平，通过泛素化IP实验分析蛋白泛素化状态，并利用Co-IP技术研究蛋白间相互作用。体内实验通过裸鼠成瘤模型验证TCEB2对肿瘤生长和巨噬细胞极化的影响。

研究结果首先揭示：M2巨噬细胞极化在TNBC中显著激活

通过组织样本分析发现，TNBC组织中M1型巨噬细胞标志物(iNOS、IL-23、IL-1β)表达显著降低，而M2型标志物(Arg1、VEGF、IL-10)表达升高。TCEB2在TNBC组织和细胞系中显著高表达，且与M2型细胞因子表达呈正相关，提示TCEB2上调可能与M2极化密切相关。

TCEB2增强TNBC细胞恶性表型并促进M2极化

功能实验表明，TCEB2敲低显著抑制TNBC细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过Transwell共培养系统发现，TCEB2沉默的TNBC细胞诱导巨噬细胞向M2极化的能力明显减弱，CD163⁺ M2型标志物比例下降，而CD80⁺ M1型标志物比例上升。值得注意的是，流式细胞术检测发现TNBC条件培养的巨噬细胞中存在CD80⁺CD163⁺混合表型群体，提示TNBC微环境可能诱导巨噬细胞出现非经典极化状态。

TCEB2介导Slit2泛素化降解机制

研究人员发现Slit2在TNBC中低表达，且TCEB2敲低可上调Slit2蛋白水平而不影响其mRNA表达。CHX追踪实验证实TCEB2沉默减缓Slit2蛋白降解速率。蛋白酶体抑制剂MG132处理可逆转TCEB2过表达导致的Slit2下调。泛素化分析显示Slit2在TNBC组织中主要发生K63连接的多泛素化降解。

TCEB2通过招募NEDD4介导Slit2 K63泛素化

Co-IP实验证实TCEB2与Slit2直接结合，生物信息学预测提示NEDD4可能参与Slit2泛素化过程。进一步实验证明NEDD4与Slit2和TCEB2均存在直接相互作用。NEDD4敲低可降低Slit2的总体泛素化、K63和K48泛素化水平，而TCEB2过表达可增强Slit2 K63泛素化，二者共转染则削弱泛素化效应，表明TCEB2通过招募NEDD4介导Slit2 K63泛素化降解。

Slit2介导TCEB2对巨噬细胞极化的调控

外源性Slit2处理可促进巨噬细胞向M1表型极化。救援实验表明，Slit2敲低可逆转TCEB2沉默对TNBC细胞恶性表型和M2极化能力的抑制作用，恢复Slit2分泌水平，证实Slit2是TCEB2下游的关键效应分子。

体内实验验证TCEB2的调控功能

裸鼠成瘤实验显示TCEB2敲低显著抑制肿瘤生长，降低Ki67增殖指数和CD163⁺ M2型巨噬细胞浸润，增加CD80⁺ M1型细胞比例，同时调节肿瘤组织中M1/M2相关细胞因子的表达平衡。

研究结论与讨论部分指出，该研究首次揭示TCEB2/NEDD4/Slit2轴在TNBC免疫微环境调控中的关键作用。TCEB2通过招募E3泛素连接酶NEDD4，介导Slit2的K63连接多泛素化降解，从而解除Slit2对M1型巨噬细胞极化的促进作用，最终导致TNBC微环境中M2型TAMs的富集和肿瘤进展。该发现不仅深化了对TNBC免疫逃逸机制的理解，更重要的是为开发靶向TME的免疫治疗策略提供了新思路。针对TCEB2-NEDD4相互作用或Slit2信号通路的干预措施，可能成为改善TNBC免疫治疗疗效的新途径。此外，研究中发现的CD80⁺CD163⁺混合表型巨噬细胞也提示TNBC微环境中巨噬细胞极化的复杂性，值得进一步探究其功能意义和临床价值。