肿瘤细胞全球染色质可及性增高的单细胞成像定量研究揭示表型可塑性的新机制

《iScience》：Quantitative single-cell imaging suggests increased global chromatin accessibility in tumor versus non-tumor cell lines

本刊推荐：为解决表型可塑性定量评估难题，研究人员开发了基于DNA结合染料的染色质可及性成像检测方法。研究发现肿瘤细胞全球染色质可及性显著高于正常细胞，致癌转化可快速增加染色质可及性。该技术为癌症预后评估提供了潜在的新型生物标志物。

　　

在癌症研究领域，科学家们长期关注着一个关键问题：为什么某些肿瘤细胞能够如此灵活地改变自身特性，从而获得转移能力和治疗抵抗性？这种被称为"表型可塑性"的现象与肿瘤的恶性进展密切相关，然而其背后的分子机制至今尚未完全阐明。理论上，细胞在不同转录程序间切换的难易程度可能取决于染色质可及性——即基因组DNA对转录机器和其他蛋白复合物的开放程度。但由于缺乏简单可靠的定量方法，这一假设一直难以得到直接验证。

传统的染色质可及性检测技术如ATAC-seq或核酸酶测序虽然能够识别特定基因组区域的 accessibility差异，但在量化单个细胞整体染色质可及性方面存在明显局限。这些方法不仅操作繁琐、通量低，还需要复杂的生物信息学分析，而且不同样本间的比较需要 spike-in controls进行标准化，无法应用于单细胞水平的比较。图像分析方法虽然能够评估染色质凝集程度的差异，但仍不能准确测量单个细胞核内可及DNA的总量。

在这一研究背景下，Roswell Park综合癌症中心的Mairead Commane、Vidula Jadhav、Katerina Leonova等研究人员在《iScience》上发表了一项创新性研究，开发了一种基于DNA结合荧光分子的简单定量方法，能够准确比较细胞间的全球染色质可及性差异。

研究人员采用的主要技术方法包括：使用多种DNA结合染料（PI、DAPI、Hoechst 33342、SYBR Green）进行核染色；通过宽场自动成像技术定量核荧光强度；利用表观遗传药物（CBL0137、TSA、panobinostat等）调控染色质状态；采用EdU标记进行细胞周期分析；并通过致癌基因（HRasV12和p53 dominant negative mutant）转化人类和小鼠细胞建立肿瘤模型。

理论假设与实验优化

研究基于一个重要观察：某些小分子与游离DNA的结合能力优于核小体DNA。DNA intercalators（嵌入剂）如propidium iodide（PI）和ethidium bromide通过平面杂环 moiety插入碱基对之间，这需要碱基对间距增加约2倍。而核小体DNA的空间和超螺旋 constraints限制了这种结合。类似地，minor groove binders（小沟结合剂）如DAPI或Hoechst也无法接触到面向组蛋白的DNA minor groove。

研究人员首先优化了实验条件，发现使用4%多聚甲醛（PFA）固定、RNase A处理以及DNA intercalator染料（特别是PI）的组合能够最灵敏、稳健地检测染色质可及性变化。他们比较了不同参数（核大小、核面积、平均荧光和积分荧光），最终选择平均核荧光作为染色质可及性的测量指标，因其对细胞周期阶段的依赖性较小。

染色质可及性与表观遗传药物

使用核小体 destabilizing compound CBL0137作为染色质去浓缩诱导剂，研究人员证实所有测试的DNA染料都能检测到染色质可及性的增加，其中intercalators（特别是PI和SYBR Green）的反应最为明显。他们还测试了多种表观遗传药物（HDAC抑制剂TSA、panobinostat、valproic acid、vorinostat和BET抑制剂JQ1）的效果，发现所有HDAC抑制剂都能增加PI的核积累，这与这些药物的已知作用机制一致。

细胞周期与染色质可及性

通过EdU标记实验，研究人员发现S期细胞虽然积累了更多染料分子，但这主要是由于其DNA含量更高。当比较DNA含量相近的细胞时，DNA复制本身并不会使染色质在核水平上更易接近。然而，他们观察到循环肿瘤细胞比静止细胞具有更开放的染色质状态，这种增加不能仅用DNA长度增加来解释。

肿瘤vs正常细胞的染色质可及性

研究最令人瞩目的发现是，在所有测试的同基因系统和非同基因系统中，肿瘤细胞都显示出比正常细胞更高的染色质可及性。在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）模型中，p53敲除并经HRasV12转化的细胞显示染色质可及性增加，而在体内形成的肿瘤细胞中这一现象进一步加剧。在人类细胞中，正常皮肤成纤维细胞（NDF）和纤维肉瘤细胞（HT1080）的比较显示，后者在基础条件下和CBL0137处理后都积累了更多染料。

研究人员还测试了乳腺和肾脏来源的细胞系，包括 immortalized mammary epithelial cell line MCF10A和三株乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、BT549和MCF7），以及肾脏上皮细胞和三株肾细胞癌细胞系（ACHN、RCC45和RCC54）。在所有情况下，肿瘤细胞都显示出比非肿瘤细胞更高的平均核荧光信号。

致癌转化增加染色质可及性

通过用p53 dominant negative inhibitor和突变HRasV12癌基因（GR）转化NDF和MCF10A细胞，研究人员发现转化细胞比非转化细胞积累了更多染料，表明转化细胞具有更开放的染色质状态。这一发现在两个独立生成的转化细胞系（GR1和GR2）中都得到了证实。

讨论与意义

这项研究开发的基于DNA结合染料的染色质可及性成像定量方法，为研究表型可塑性提供了简单可靠的工具。与现有技术相比，该方法具有操作简便、通量高、可应用于单细胞水平和组织切片等优势。

研究发现肿瘤细胞全球染色质可及性显著高于正常细胞，且致癌转化可快速诱导染色质可及性增加，这为理解肿瘤细胞表型可塑性提供了重要机制解释。染色质的整体 destabilization可能通过减少每个细胞的组蛋白数量、存在使核小体更不稳定的组蛋白修饰或突变、异染色质蛋白的丢失或使核小体更开放的蛋白质（如HMG proteins）的过表达来实现。

研究人员提出，染色质去浓缩程度可能与肿瘤预后相关，通过染色患者肿瘤切片并评估染色质可及性与患者结局的相关性，可能开发出简单而通用的预后生物标志物。如果开发出适当的荧光探针，这一方法甚至可应用于体内成像。

该研究的局限性包括需要针对总DNA长度进行标准化，以及需要更好理解不同DNA配体报告染色质状态的机制差异。然而，这一简单而定量化的方法为了解细胞群体内和群体间的染色质状态差异提供了强大工具，有望推动癌症研究和临床诊断的发展。