异源二聚体适配体提升夹心ELASA与斑点杂交检测灵敏度：钩端螺旋体病诊断新策略

本文创新性地利用poly d(A)-poly d(T)双链介导功能化策略构建异源二聚体适配体LepDapt-H1b，显著提升了夹心酶联适配体吸附检测（ELASA）和斑点杂交法对致病性钩端螺旋体的检测灵敏度（LOD分别达4 CFU/mL和10 CFU/mL），为钩端螺旋体病（leptospirosis）的早期诊断提供了更高效的技术平台。

　　

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Introduction:

适配体（Aptamers）是一类能通过系统性进化配体指数富集技术（SELEX）筛选获得的单链DNA或RNA，可凭借高特异性和灵敏度结合多种靶标（从金属离子、小分子至整个细胞）。其结合作用力包括范德华力、静电相互作用、氢键、π-π堆积等。

Materials

生物素化poly (dT)₂₀及所有含poly d(A)₂₅的异源二聚体适配体购自马来西亚Apical Scientific公司。聚HRP-链霉亲和素（Poly HRP-Streptavidin）购自美国Invitrogen公司，牛血清白蛋白（BSA）购自法国Biosera公司。SuperBlock?封闭缓冲液、四甲基联苯胺（TMB）及Nunc MaxiSorp?平底96孔板购自美国Thermo Scientific公司。硝化纤维素膜（Nitrocellulose membrane）用于后续实验。

poly d(A)-poly d(T) duplex mediated-functionalization strategy is a viable strategy to functionalize LepDapt-5a aptamer

前期研究中，我们筛选出针对LipL32蛋白的LepDapt-5a DNA适配体用于致病性钩端螺旋体检测。本研究比较了两种适配体功能化策略：在LepDapt-5a的3’末端添加poly d(A)₂₅序列，并分析其二级结构（图1a）。结果显示该策略能有效维持适配体结合活性。

Conclusion:

我们成功通过不同长度连接子构建了LepDapt-2a与LepDapt-5a组成的异源二聚体适配体变体，其中LepDapt-H1b表现出最强结合效能。以其作为检测适配体的夹心ELASA法检测限达10¹ CFU/mL（未稀释100%血清中为10³ CFU/mL），显著优于单一适配体性能。