综述：过去15年PCR方法学与技术进展的综合评述

本综述系统回顾了PCR（聚合酶链反应）技术近15年的重大进展，涵盖从基础原理到高端技术（如qRT-PCR、dPCR、微流控PCR等）的全方位发展，重点突出了其在精准医疗（如单分子检测）和即时诊断（POCT）领域的革命性应用，同时探讨了机器学习在数字PCR系统中的创新融合，为生命科学研究者提供了全面而前沿的技术视野。

引言

自Mullis等人于1988年发明聚合酶链反应（PCR）以来，该技术以其操作简便、高特异性和高灵敏度的特点，深刻推动了生命科学多个领域的发展。传统PCR通过30–40个循环的温控反应，可在数小时内实现百万倍的DNA扩增，即使初始样本含量极低也能达到可检测水平。随着耐热DNA聚合酶（如Taq酶）的引入，PCR实现了自动化热循环，进一步推动了包括巢式PCR、定量实时PCR（qRT-PCR）、多重PCR（mPCR）和数字PCR（dPCR）等技术的演进。近年来，微流控技术（如连续流PCR、振荡流PCR、自然对流PCR）与光热PCR（photonic PCR）的出现，更使得PCR在便携性、速度和定量精度方面取得突破性进展。

巢式PCR

巢式PCR采用两对引物进行两轮扩增，显著提高了检测的特异性和灵敏度。该技术最早由Haqqi等人于1988年提出，用于避免非特异性扩增产物的干扰。例如，在动脉粥样硬化斑块中检测porphyromonas gingivalis和actinobacillus concomitant等病原体时，巢式PCR展现出优异的性能。尽管如此，其操作流程较为复杂，且在定量分析方面精度有限。

定量实时PCR（qRT-PCR）与多重PCR（mPCR）

qRT-PCR通过引入荧光标记系统，实现了对扩增产物的实时监测与定量分析，广泛应用于基因表达研究和病原体检测。多重PCR则可在同一反应体系中利用多对引物同时扩增多个靶点，大幅提升检测通量。然而，不同引物之间的竞争可能导致假阳性结果，需通过优化反应条件加以控制。

数字PCR（dPCR）与微流控集成

数字PCR摒弃了标准曲线，通过将样本分割为微滴（ddPCR）或物理隔离的微腔室（microchamber PCR）实现核酸分子的绝对定量，灵敏度可达单分子水平。这一技术尤其适用于低丰度突变检测、液体活检和病原体超早期诊断。微流控技术的融合进一步推动了dPCR在即时检测（POCT）中的应用，使其具备便携、自动化和低耗材的特点。

光热PCR与机器学习辅助分析

光热PCR利用光热效应实现超快速升降温，显著降低热惯性和能耗，同时保持高灵敏度和特异性，代表了下一代PCR技术的发展方向。此外，机器学习与神经网络技术在数字PCR系统中的应用，显著提升了芯片分析中阳性微腔室的识别精度，进一步增强了定量结果的可靠性。

结论

PCR技术从基础DNA扩增工具逐步发展为支撑精准医疗和即时诊断的核心平台。其演进历程体现了方法学与工程技术的深度融合，尤其在微流控集成、绝对定量和人工智能辅助分析等方面取得重大突破。未来，PCR技术将继续向高通量、超快速、便携式和智能化方向拓展，为生命科学和临床医学提供更强大的技术支持。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本研究成果的财务或个人关系冲突。

致谢

本研究得到安徽三联学院自然科学科研项目（KJZD2025004）和上海市科学技术委员会（No.19ZR1477500）的资助。