精神分裂症遗传小鼠模型脑转录组荟萃分析揭示纹状体和丘脑的关键失调机制

本研究针对精神分裂症(SCZ)高度遗传性但机制不明的现状，通过对7个SCHEMA风险基因(Akap11、Dagla、Gria3、Grin2a、Sp4、Srrm2、Zmym2)缺失突变小鼠进行多脑区转录组荟萃分析，发现纹状体和丘脑是关键汇聚区域。纹状体普遍出现突触和氧化磷酸化相关基因集下调，而丘脑转录组表型将突变体分为两类：仅与SCZ/双相障碍(BP)相关的突变体呈现突触基因集上调，同时伴有发育迟缓/智力障碍(DD/ID)的突变体则显示下调。该研究揭示了精神分裂症遗传模型中脑转录组表型的异同，支持纹状体紊乱和突触功能障碍的参与，并指出丘脑的关键作用。

精神分裂症是一种严重影响人类心理健康的精神疾病，全球约有0.7%的人口受其影响。尽管遗传因素在其发病机制中占据重要地位（遗传度约80%），但其具体的生物学机制仍不明确。全基因组关联研究(GWAS)已识别出287个显著相关的基因位点，但这些常见变异通常效应值较小（比值比<1.2），且多位于基因组的非编码区，使得从遗传变异到机制理解的路径充满挑战。近年来，精神分裂症外显子组测序荟萃分析(SCHEMA)联盟发现了罕见编码变异，这些变异显著增加精神分裂症的风险，涉及10个达到外显子组-wide显著水平的基因，以及32个错误发现率(FDR)<5%的基因。这些“SCHEMA基因”中的蛋白截短变异(PTVs)和有害错义变异对疾病风险具有较大影响（比值比2-50），并导致特定基因功能丧失(LoF)，为生物学研究提供了更清晰的切入点。

在此背景下，研究人员假设，携带SCHEMA基因杂合功能缺失突变的小鼠模型会在大脑中表现出一定程度的表型汇聚，这可能通过多脑区系统的转录组分析（批量RNA-seq）来揭示，从而为理解精神分裂症的分子机制和系统水平的大脑改变提供见解。为此，研究团队对7个SCHEMA基因（Akap11、Dagla、Gria3、Grin2a、Sp4、Srrm2、Zmym2）的缺失突变小鼠进行了大规模的脑转录组数据荟萃分析，并以与自闭症谱系障碍(ASD)和DD/ID相关的Grin2b突变小鼠作为对照。研究聚焦于杂合突变小鼠，因为人类SCHEMA病例的基因型即为杂合子。批量RNA测序在6个脑区（海马、前额叶皮层(PFC)、黑质、纹状体、体感皮层(SSC)和丘脑）和两个年龄点（1个月和3个月，分别对应小鼠的青春期和成年早期）进行，以捕捉转录组变化。

研究采用的主要技术方法包括：批量RNA测序技术对多脑区样本进行转录组分析；差异表达基因(DEGs)鉴定（使用DESeq2进行统计检验，FDR<0.05为阈值）；转录组-wide差异表达分析(TRADE)评估全转录组影响；基因集富集分析(GSEA)探索功能通路变化；Stouffer's Z-score荟萃分析整合多模型数据；细胞类型反卷积(MuSiC)评估细胞比例变化；以及与人类精神分裂症转录组数据的比较分析。样本来源于不同遗传背景的小鼠模型，所有实验均使用杂合突变小鼠与野生型同窝对照进行比较。

研究结果显示，所有研究的脑区均受到影响，但纹状体和丘脑 emerged as key brain regions of convergence。基于差异表达基因数量(DEGs)和转录组-wide影响(TWI)评分，纹状体具有最高的meta-TWI评分，丘脑次之。纹状体在所有模型中均显示突触和氧化磷酸化相关基因集的下调。在丘脑中，突变体根据转录组表型分为两组：仅与精神分裂症和双相障碍相关的突变体（如Akap11、Dagla、Gria3、Sp4）显示突触相关基因集上调，而与发育迟缓/智力障碍相关的突变体（如Srrm2、Zmym2）则显示下调。Grin2a突变体的表型介于两者之间。

具体到纹状体，在1月龄时，荟萃分析揭示了873个显著改变的GO术语（FDR<0.05）。许多顶级基因集与突触相关，尤其是突触前和突触小泡相关术语（如“synaptic vesicle”、“vesicle-mediated transport in synapses”）在所有SCHEMA突变体中一致下调。其他更广泛的突触相关术语（如突触膜、突触组织、突触可塑性）或突触后相关术语也显著改变， mostly in a downward direction。在Dagla和Srrm2突变体中，部分突触相关基因集上调。细胞类型反卷积分析显示，突变小鼠与野生型对照之间在细胞比例上没有显著差异，表明这些转录组变化可能是细胞内表达改变的结果。在基因水平上，许多突触或突触传递相关基因在突变体中显著下调，包括Piccolo(Pclo)、Sv2a、Bassoon(Bsn)和syntaxin 1B(Stx1b)，这些基因与突触前和突触小泡动力学相关。值得注意的是，Pclo和Sv2a与精神分裂症的遗传关联证据日益增多。其他下调的基因包括神经丝轻链(Nefl)、神经丝重链(Nefm)和神经元pentraxin受体(Nptxr)，它们的蛋白产物被认为是神经元损伤和神经退行性变的潜在生物标志物。Grin1（NMDA受体的必需亚基）的下调与精神分裂症的NMDA功能低下假说一致。

与细胞呼吸和氧化磷酸化相关的基因集（如“cellular respiration”、“mitochondrial respiratory chain complex I”、“mitochondrial respirasome”）在纹状体中显著受影响，表明SCHEMA突变体中脑能量代谢改变。有趣的是，虽然这些线粒体呼吸基因集在研究的SCHEMA突变体的纹状体中显示下调，但在Grin2b突变体的纹状体中它们却上调。这一特征可能反映了与精神分裂症相关的小鼠突变体和与DD/ID相关的小鼠突变体之间纹状体功能障碍的差异。事实上，在线粒体呼吸复合物的过度激活先前已在神经发育障碍Fragile X综合征的Fmr1敲除小鼠模型的纹状体中有报道。虽然线粒体呼吸相关基因集在许多脑区的不同突变体中发生改变，但SCHEMA突变体(SCZ)与Grin2b突变体(ASD)之间这些通路呈现相反且显著变化的特定模式仅在纹状体中发现。在基因水平上，Akap11和Grin2a突变体（显示基因集最强烈下调）中氧化磷酸化基因的差异表达效应大小与Grin2b突变体中的变化呈显著反相关。此外，纹状体中线粒体呼吸相关基因集的下调在与DD/ID无PTV关联的SCHEMA突变体中最强，而在与DD/ID相关的Srrm2和Zmym2突变体中信号较弱或缺失，在这方面，它们与Grin2b更相似。研究人员推测，纹状体中线粒体呼吸的转录组表型差异可能反映了精神分裂症与DD/ID/ASD遗传小鼠模型之间的病理生理网络差异。

总体而言，Srrm2和Dagla突变体在1月龄纹状体中的转录组效应特别高度相关，尽管它们的分子功能明显不同。特别令人感兴趣的是，Srrm2和Dagla突变体在纹状体中具有显著(FDR<0.05)的“response to dopamine”基因集上调，包括多巴胺受体Drd1和Drd2的表达增加，这些多巴胺受体与精神分裂症高度相关。除了多巴胺受体，Srrm2和Dagla突变体还显示几种血清素受体基因（Htr1b、Htr1d、Htr2c、Htr4）以及涉及GPCR信号传导的基因（Adcy5、Rgs8、Rgs9）的上调，这些基因可能在多巴胺和血清素受体下游发挥作用。Comt（一种多巴胺代谢酶）的减少在Grin2a杂合和纯合突变体的大脑中的RNA和蛋白水平均得到证实。在这里，研究人员发现Comt mRNA在Gria3和Zmym2突变体的1月龄纹状体中也下降。然而，在3个月时，除Grin2a突变体外，这种Comt下调的趋势并不一致。

纹状体荟萃分析中鉴定的许多改变基因在人类精神分裂症患者的死后纹状体中也差异表达。例如，除了在Dagla和Srrm2突变体中上调外，DRD2在人类中也显著增加。荟萃分析中的显著基因富集于人类精神分裂症DEGs。Comt在荟萃分析中显著下调，在精神分裂症患者的纹状体中也显著降低。纹状体荟萃分析中最显著的hitPlce1在人类SCZ纹状体中也升高。Plce1编码磷脂酶C epsilon 1，该酶催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸水解，产生两个第二信使：肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)和二酰基甘油(DAG)。为了更广泛地评估SCHEMA小鼠突变体和人类SCZ之间纹状体RNA-seq变化的相似性，研究人员使用人类上调和平调的DEGs作为基因集，对每个突变体进行了GSEA。这揭示了有趣的模式，尤其是在1月龄时。唯一显示人类上调DEGs上调的突变体是Dagla和Srm2，它们在相关基因集（如“postsynapse”和“response to dopamine”）中表现出强烈的转录组相似性。另一方面，人类下调DEGs在“SCZ/BP特异性”突变体（那些与DD/ID无遗传关联的突变体：Akap11、Dagla、Gria3和Sp4）中显著富集。值得注意的是，与ASD/DD/ID相关但与SCZ无关的Grin2b显示该基因集的相反上调。

纹状体GO荟萃分析中最统计学显著的变化是“myelin sheath”基因集在SCHEMA突变体中的下调。然而，虽然“myelin sheath”基因集在五个SCHEMA突变体中显著下调，但更具体与髓鞘相关的GO术语，如“myelination”和“ensheathment of neurons”，仅在Akap11和Sp4突变体中显著下调。这种明显的不一致表明“myelin sheath”发现部分由与髓鞘形成不直接相关的基因驱动；事实上，在SCHEMA突变体中“myelin sheath”基因集最一致下调的基因主要与糖酵解（如Gapdh、Aldoa、Pkm、Pgam1）和细胞骨架（如Nefm、Nefl、Plec、Tuba1b、Tubb4b）相关。

在3月龄时，SCHEMA突变模型之间纹状体通路汇聚的程度（通过Stouffer荟萃分析中显著通路数量衡量）比1月龄时更有限，显示来自GSEA荟萃分析的更少且更弱显著的基因集。例如，突触和细胞呼吸相关基因集在3月龄时在SCHEMA突变体的纹状体中不再通过荟萃分析显著下调。在一些单独的SCHEMA模型中这些通路下调，但在其他模型中它们上调或变化很小。

前额叶皮层(PFC)在人类和灵长类中高度发达，PFC功能障碍与精神分裂症有关。PFC在1或3月龄时对所有SCHEMA突变体显示名义显著的转录组-wide影响评分，除了Akap11和Dagla，它们的TWI评分在1或3月龄时的任何脑区均未达到统计学显著性。更多SCHEMA突变体（7个中的5个）在PFC中显示显著的TWI，尽管TWI评分在PFC中通常较低。有趣的是，Grin2b杂合突变体在PFC中没有显示显著的TWI，尽管对大多数其他脑区有显著影响。这支持了最近的报告，表明在ASD中，PFC不像其他皮质区域那样受到干扰。尽管PFC有转录组-wide影响，但与其他脑区相比，PFC在SCHEMA小鼠突变体中显示的转录组汇聚水平较低。荟萃分析显示，PFC中特定的基因和通路水平变化在不同SCHEMA突变模型之间非常异质，突变体之间的差异表达最多只有适度的相关性（例如Sp4和Grin2a之间R=0.31）。事实上，两个分子功能最相似的SCHEMA基因，Gria3和Grin2a（均编码谷氨酸受体亚基），在它们对PFC转录组的影响上显著反相关（R=-0.46）。

在1月龄时间点，PFC的GSEA荟萃分析中的一些顶级hit包括髓鞘、细胞呼吸、突触前和突触小泡相关术语的下调，这与纹状体相似。然而，这些术语在PFC中并不像在纹状体中那样在所有突变体中一致或稳健地下调，并且在大多数情况下，GSEA结果仅在少数SCHEMA突变体中达到个体水平的FDR显著性，有时变化方向相反。此外，Grin2b突变体在PFC的许多这些通路中显示与SCHEMA小鼠相似的变化。总体而言，突触相关基因集在SCHEMA突变体的PFC中常见改变，但它们的方向一致性或显著性频率低于纹状体，这与PFC中常见基因或常见通路变化数量较少一致。

与1月龄PFC和1月龄纹状体一样，“myelin sheath”也是3月龄PFC中最显著改变的术语，在Akap11、Dagla、Grin2a和Sp4突变体中显著下调。然而，与1月龄纹状体一样，“myelination”基因集仅在Akap11和Sp4突变体中显著下调。在所有SCHEMA突变体中该基因集最一致下调的基因更多与细胞骨架术语（如Actb、Actg1、Arf6、Tuba1b）、轴突（如Nefh、Dpysl2）和线粒体（如Hspa9、Immt、Prdx3、Cox5a）相关，而不是特定的髓鞘成分。

人类PFC的基因表达差异已通过使用死后脑组织进行RNA-seq研究，因此研究人员将差异表达结果与其中一项最大规模的研究进行了比较。批量RNA-seq结果在SCHEMA突变小鼠的PFC和人类精神分裂症患者的PFC之间总体相关性较弱（如果存在的话）（R一般<0.1）。这并不令人惊讶，因为除了物种差异外，人类脑样本在许多方面高度异质，而我们的脑样本来自相同性别、年龄和遗传背景的小鼠。此外，人类数据来自死后个体，他们具有可变的疾病寿命和相关的环境压力及药物使用，所有这些都可能以小鼠中不存在的方式影响脑转录组。研究人员创建了人类精神分裂症PFC研究中上调和下调DEGs的基因集，并使用这些注释基因集进行了GSEA。在研究的SCHEMA突变体中，只有Grin2a和Akap11在其上或下调基因中具有人类DEGs的显著富集。值得注意的是，人类研究中的下调DEGs在3月龄Grin2a突变体的PFC下调基因中富集，这是Grin2a突变体显示最多转录组变化的年龄。尽管不具统计学显著性，3月龄Grin2a突变体也显示人类上调DEGs的上调。在3月龄时，Grin2a突变体纹状体也显示人类DEGs在其上调和下调基因中的显著富集，与人类纹状体DEGs的效应方向匹配。通过这些转录组比较，3月龄的Grin2a小鼠是在PFC和纹状体中最类似于人类精神分裂症的SCHEMA突变体。在Akap11突变体的情况下，人类SCZ的上调DEGs在1月龄PFC的上调基因中显著富集。研究人员注意到，Akap11突变体大脑在皮质突触的蛋白质组学研究中也显示与人类SCZ PFC有些相似。

尽管丘脑转录组在精神分裂症相关研究中不如PFC或纹状体研究充分，但研究人员发现丘脑具有高度的转录组-wide影响和跨SCHEMA模型的高水平转录组汇聚，尤其是在1月龄时。丘脑GSEA结果的荟萃分析显示，大多数最显著改变的基因集是上调的，与纹状体相反，在纹状体中大多数改变的基因集是下调的。如对纹状体所观察到的，丘脑中具有最高Z分数的基因集与突触相关——这里研究人员观察到突触前和突触后术语的上调，这与1月龄纹状体中突触相关术语的下调形成对比。丘脑中突触术语的meta上调主要由四个SCHEMA突变体驱动——Akap11、Dagla、Gria3和Sp4。有趣的是，这些是本研究中没有与DD/ID遗传关联的四个SCHEMA突变体（因此称为“非DD/ID相关”），并因此可能被认为更特异性于SCZ/BP而不是一般神经发育障碍。除了突触相关基因集，与RNA加工和结合相关的术语（mRNA结合、mRNA加工调控、细胞质核糖核蛋白颗粒等）在荟萃分析中常见改变。

仔细检查突触相关基因集后，研究人员注意到非DD/ID与DD/ID相关SCHEMA突变体之间存在显著分歧：即突触基因集在非DD/ID组（Akap11、Dagla、Gria3、Sp4）中上调，但在DD/ID组（Srrm2、Zmym2）中未改变甚至下调。Grin2a并不完全适合DD/ID或非DD/ID类别，因为某些错义突变与DD/ID相关，而蛋白截短/LoF突变（如本研究所模拟）尚未有关联。有趣的是，本研究中的杂合Grin2a LoF突变体具有介于上述两组之间的丘脑转录组表型，但更类似于非DD/ID组。此外，通过利用synGO本体论，丘脑中特定的突触相关基因集变化在这些“非DD/ID”SCHEMA突变体中非常相似，基因集如“presynaptic active zone”、“postsynaptic specialization”和“postsynaptic density”在所有四个模型中上调。在个体基因水平上，Akap11、Dagla、Gria3和Sp4突变体之间的变化也非常相似，并且该组中最常见上调的突触相关基因（通过秩和分析识别）在DD/ID相关突变体中显示无变化或下降，Grin2a再次处于中间状态。在显示DD/ID与非DD/ID相关SCHEMA突变体之间差异变化的有趣突触相关基因中，有Atp2b2（一种钙泵，与双相障碍/SCZ的遗传关联正在浮现）、Gabrg2（一种GABA-A受体亚基）和neurexin 1(Nrxn1，其缺失与精神分裂症相关)。通过细胞类型反卷积分析，研究人员发现任何突变体与其野生型同窝对照之间在丘脑细胞比例上没有显著差异，表明这些突触相关RNA-seq变化更可能是细胞水平表达改变的结果，而不是细胞类型组成的改变。

值得注意的是，基于丘脑的转录组表型，Grin2b突变小鼠（ASD/DD/ID的遗传模型）在突触相关基因和基因集上显示与Srrm2和Zmym2（DD/ID相关SCHEMA基因）突变体相似的变化，但与Akap11、Dagla、Gria3和Sp4（非DD/ID SCHEMA基因）突变体显著不同。

研究人员通过对来自各种CNS疾病的人类GWAS和外显子组测序研究衍生的疾病相关基因集进行GSEA，进一步研究了DD/ID相关和非DD/ID相关SCHEMA突变体在丘脑中的这种分歧。有趣的是，该分析强化了DD/ID与非DD/ID突变体的分离，基于几种脑疾病相关基因的富集分数，特别是精神分裂症（常见变异和SCHEMA基因）以及神经发育延迟(NDD)和ASD（从ASD和NDD的外显子组测序研究中识别的基因）。具体而言，在这些疾病相关基因集中，丘脑中最强烈的下调在Grin2b突变体中观察到，在Srrm2和Zmym2突变体中也看到较弱的下调。相比之下，非DD/ID突变体（Akap11、Dagla、Gria3、Sp4）显示丘脑中这些精神分裂症、NDD和ASD基因集的上调。

由于丘脑是连接多个脑区的重要感觉中继枢纽，研究人员调查了丘脑中突触相关基因集的变化是否与其他脑区跨突变体的任何基因集变化相关。他们通过计算跨突变体来自GSEA的标准化富集分数(NES，代表富集相对大小)的Pearson和Spearman相关性来做到这一点。与丘脑中突触相关基因集显著相关的基因集数量最多的是在体感皮层(SSC)中观察到。事实上，丘脑中突触相关基因集富集与SSC中突触相关基因集富集之间存在一致的抗相关——在丘脑中突触相关基因集上调的突变体中，它们在SSC中下调或趋于下调，反之亦然。此外，“synapse”基因本体术语中基因的平均log2倍变化(log2FC)在丘脑和SSC之间显示强烈的抗相关（Pearson's R=-0.92, p=0.001）——丘脑中突触基因平均变化更正的突变体在SSC中具有更负的平均变化，反之亦然。丘脑和SSC之间改变基因表达的这种强烈抗相关程度可能与区域之间的功能连接有关。

DD/ID相关与非DD/ID SCHEMA突变体在丘脑中的分歧超出了突触相关术语。跨突变模型的GSEA结果的总体相关性显示了一个清晰的模式，其中Akap11、Dagla、Gria3和Sp4彼此非常相似，并且与Srrm2、Zmym2和Grin2b抗相关，Grin2a落在中间某处。研究人员搜索了在其他基因集中，这些非DD/ID SCHEMA突变体中所有一致显著改变且方向相同的基因集，他们发现与细胞外基质相关的基因集强烈下调，与GTPase结合和应激颗粒相关的基因集在非DD/ID SCHEMA突变体（Akap11、Dagla、Gria3、Sp4）中一致上调。值得注意的是，这些相同的基因集在DD/ID相关SCHEMA突变体（Srrm2、Zmym2）中显示相反调控或变化很小，并且在Grin2b中显示一致、显著的相反变化。在这种意义上，DD/ID相关SCHEMA突变体在丘脑中显示与Grin2b突变体相似的GSEA方向变化，Grin2b是一个与DD/ID/ASD相关但与精神分裂症无关的基因。

由于丘脑参与睡眠调控，并且睡眠障碍是精神分裂症的常见特征，研究人员额外检查了“circadian rhythm”基因集，发现它也显示这种分歧，在非DD/ID SCHEMA突变体中显著上调，在DD/ID相关SCHEMA突变体中趋于下调，并在Grin2b突变体中显著下调。

通过对基于罕见变异人类遗传学的多种精神分裂症小鼠模型（SCHEMA突变小鼠）进行系统转录组分析，研究人员揭示了可能与精神分裂症病理生理学相关的分子失调和系统水平干扰的潜在通路。研究表明，在七个不同SCHEMA基因（所有这些基因均显著增加人类精神分裂症风险）中杂合（或半合）突变对小鼠脑转录组具有相当异质的影响。转录组-wide影响、最受影响脑区、最受影响年龄以及改变的精确基因和通路在所有SCHEMA突变模型之间显示相当大的变异。这种异质性强调，精神分裂症的风险——这是一个仅基于临床症状而非疾病机制理解的诊断——可能源于许多不同的原因，这些原因可以表现为大脑中各种转录组扰动。在这种背景下，不同的疾病相关遗传变异（如这些不同的SCHEMA突变）不会以统一和剧烈的方式改变脑转录组也就不足为奇了。相反，这些SCHEMA突变可以在大脑中产生特异且不同的分子效应，这与精神分裂症作为精神病学诊断的已知临床异质性一致。

尽管跨突变体的详细转录组表型存在异质性，但研究人员能够识别SCHEMA突变体之间的汇聚和重叠。系统研究——使用无假设驱动的转录组学跨不同脑区和年龄对多个精神分裂症风险基因进行协调表征——以前尚未应用于如此大规模的精神分裂症小鼠模型。这种全面方法允许对每个单独SCHEMA基因在小鼠中突变时进行深入研究，以及跨不同突变体的表型荟萃分析，从而有助于缩小哪些效应最可能与更广泛的疾病背景相关。先前的一项研究通过小鼠大脑中的稀疏细胞特异性突变表征了许多ASD相关基因的功能，并识别了汇聚的细胞机制，但这种方法无法解决在多个不同小鼠突变体的完整大脑中哪些区域和网络受影响