维生素K依赖性蛋白γ-谷氨酰羧化酶的结构与功能机制解析：为凝血及骨代谢疾病提供新靶点

本研究针对维生素K依赖性蛋白γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）的催化机制不明确问题，通过高分辨率冷冻电镜技术解析了人源GGCX与维生素K及凝血因子IX/X的复合物结构，揭示了其双催化机制和底物依赖性调控特性，为维生素K代谢相关疾病的靶向治疗提供了重要理论依据。

　　

在人体复杂的生物化学网络中，维生素K依赖性蛋白（VKDPs）的γ-羧化修饰是维持生命活动的重要环节。这种由γ-谷氨酰羧化酶（GGCX）催化的翻译后修饰，不仅关乎血液凝固功能的正常运作，还深度参与血管钙化、骨代谢、肿瘤增殖甚至精子发生等生理病理过程。然而尽管其生物学意义重大，科学界对GGCX如何精确执行羧化反应、如何识别不同底物蛋白、以及其突变导致多种临床表型的分子机制仍知之甚少。这些知识空白严重制约了相关疾病治疗策略的开发。

针对这一瓶颈问题，北京大学第三医院乔杰、杭静团队与合作者在《Cell Research》发表了突破性研究成果。研究人员综合运用结构生物学、生物化学和计算生物学方法，首次解析了人源GGCX与维生素K及凝血因子复合物的高分辨率结构，揭示了该酶独特的工作机制和调控原理。

研究主要采用冷冻电镜（cryo-EM）技术解析蛋白结构，结合表面等离子共振（SPR）分析蛋白互作亲和力，通过分子动力学（MD）模拟研究构象变化，并利用体外羧化实验和细胞功能验证进行功能表征。所有实验均使用HEK293F细胞表达系统。

研究结果首先通过结构解析揭示了GGCX的整体架构。研究人员成功获得了2.78?分辨率的GGCX^WT-FIX（凝血因子IX）复合物结构，发现该酶包含N端跨膜结构域（TMD）、腔内侧前肽结合结构域（PBD）和具有独特拱形特征的Arch-like结构域。特别重要的是，结构中清晰显示了内源性维生素K（确定为甲萘醌-4氢醌，MKH₂-4）的结合位点，位于TM5-TM8形成的疏水口袋中。

在功能域分析中发现PBD结构域的关键作用。该结构域由PBD-1和PBD-2两个叶组成，通过二硫键（C450-C99）、氢键和盐桥等相互作用稳定其结构。突变热点分析显示，病理突变主要集中在催化中心和PBD-1/PBD-2界面，表明该区域的稳定性对GGCX功能至关重要。

Arch-like结构域表现出显著构象可塑性。分子动力学模拟显示该区域的螺旋H3和H4具有快速向内坍塌的特性，RMSF分析表明Arch-like螺旋和C端存在大幅波动（>5?）。功能实验发现H5螺旋的缺失对不同底物产生差异性影响：对FIX和FX的羧化无影响，但显著损害FVII、GAS6和蛋白S的羧化活性，提示H5以底物依赖性方式调控γ-羧化过程。

在前肽与PBD相互作用机制方面，研究发现PBD形成爪状沟槽钳制FIX前肽，作为远离催化中心的外位点（exosite）。关键相互作用包括H34^FIX与Y425^GGCX的π-π堆积、F31^FIX插入PBD-1疏水口袋以及L41^FIX与PBD-2的疏水接触。突变实验证实这些残基对结合亲和力至关重要，竞争性实验表明前肽通过竞争GGCX上的相同结合位点来促进底物结合。

维生素K结合口袋的特征被精确解析。通过催化失活突变体GGCX^AA（K217A/K218A）与FIX和FX的复合物结构（分辨率分别为2.59?和2.58?），研究人员明确了MKH₂-4的结合模式：萘醌环深埋于疏水隧道中，异戊二烯尾向外延伸。关键协调残基包括F286、F294、F299、H160等。突变验证实验表明，破坏该疏水口袋的突变严重损害γ-羧化活性和维生素K结合亲和力。不同形式维生素K的结合分析显示氢醌形式（VKH₂）的结合亲和力强于环氧化物形式（VKO），这种差异有利于氧化型VK的释放和周转。

关于Gla结构域结合，研究发现E53^FIX的γ-羧基插入带正电的口袋，与K218和MKH₂-4的萘醌环相邻。K218与萘醌环形成氢键，N159、H160和Y395协调E53侧链，N158和R436稳定Gla结构域骨架，共同构成谷氨酸结合口袋。

关键催化残基K217和K218的功能被重新界定。结构显示K217的ε-氨基通过氢键与S398和Y379连接，位于Glu碳负离子约12?外，其主要功能是稳定TMD与PBD-2的相互作用。功能实验证实K218A突变完全 abolished催化活性但不影响底物结合，而K217A损害VKDP结合却不破坏催化功能，表明这两个残基在调节GGCX活性中扮演 distinct且 complementary的角色。

研究还发现了H2-Cap转导机制。TM5-TM6环形成Cap结构屏蔽维生素K结合口袋，其与PBD-2的H2相互作用由广泛氢键网络稳定。加速分子动力学（aMD）模拟揭示了H2 opening和Cap构象转变的耦合运动，两者存在约45ns的时间延迟，运动强度呈现显著负相关（Pearson相关系数-0.675）。这种H2-Cap转导机制为理解GGCX的变构调控提供了新视角。

研究结论表明，这项工作系统阐明了GGCX催化谷氨酸γ-羧化和维生素K环氧化的分子基础与耦合机制。结构分析不仅揭示了催化机理，还阐明了关键病理突变的功能影响，突出了在推进临床抗凝治疗和细胞调控更广泛方面的潜在应用价值。该研究为理解维生素K代谢在生理和疾病中的作用提供了全面的分子框架，并为潜在的治疗干预提供了宝贵见解。

特别值得关注的是，研究发现GGCX与不同底物（BGP、FIX、FX）的结构高度保守，K217和K218基本保持不变，进一步支持了K217在介导VKDP结合和K218在催化中的关键作用。这些发现为开发针对特定GGCX功能异常的相关疾病治疗策略奠定了坚实的理论基础。