综述：无饲养细胞NK细胞扩增的最新进展作为过继细胞疗法的未来方向

本综述系统评述了NK细胞无饲养细胞扩增技术的最新进展，重点分析了细胞因子组合、抗体刺激、血液成分、纳米颗粒和水凝胶等五大策略的优劣，并指出纳米颗粒技术因其可标准化生产和长期储存的特性，在实现安全、可扩展的NK细胞治疗（ACT）方面展现出巨大潜力。

　　

1 Introduction

癌症免疫治疗，尤其是以免疫检查点抑制剂（ICIs）为代表的疗法，通过展示持久应答和相对较低的毒性，彻底改变了癌症治疗格局。尽管部分患者因此达到完全缓解，但大多数患者仍难以实现长期缓解，这促使研究者们积极寻找预测性生物标志物和联合治疗策略。在此背景下，嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法脱颖而出，尤其在血液恶性肿瘤中显示出对常规治疗无效患者的卓越疗效。其扩增并输注肿瘤靶向细胞毒性淋巴细胞的治疗概念，验证了基因和细胞疗法的潜力。

当前CAR-T细胞疗法的一个主要局限在于其自体特性，需要从患者自身的T细胞进行个性化制备，这个过程既耗时，对于晚期患者效果也往往不理想。因此，利用健康供体免疫细胞的同种异体细胞疗法，作为一种现成细胞产品的策略受到广泛关注。在用于同种异体治疗的候选效应细胞中，自然杀伤（NK）细胞具有独特优势。与T细胞不同，NK细胞不会诱发移植物抗宿主病（GvHD），并且在外周血中含量丰富，便于大规模分离。大量研究已将NK细胞视为下一代治疗平台，近期临床数据表明，CAR-NK细胞可以达到与CAR-T细胞相当的抗肿瘤功效，凸显了基于NK细胞的免疫治疗的转化潜力。

NK细胞疗法临床成功的一个关键要求是开发高效且安全的扩增方法。与T细胞相比，NK细胞的体外扩增通常更具挑战性。T细胞仅通过CD3/CD28刺激即可被强力激活和扩增，而NK细胞的激活则需要整合多种激活性和抑制性信号。这种复杂性使得寻找一个等同于CD3/CD28的单一分子组合来刺激NK细胞变得困难。因此，大量研究持续致力于开发先进的NK细胞培养方法，以期在满足临床适用性要求的同时实现强劲的扩增。

2 Feeder cell-based NK cell expansion

基于饲养细胞的NK细胞扩增是目前最广泛应用的方法，大多数饲养细胞经过γ射线照射以抑制其增殖并诱导其表达可刺激NK细胞的应激配体。饲养细胞的来源多样，包括外周血单个核细胞（PBMCs）、肿瘤细胞系和EB病毒（EBV）转化的淋巴母细胞。

使用PBMC作为饲养细胞的过程涉及从PBMC中分离出NK细胞，随后对剩余的非NK细胞进行γ射线照射后加以利用。与使用癌细胞系相比，这种利用血液中正常细胞的方法提供了更高的稳定性。使用经γ射线照射的PBMCs进行NK细胞扩增，在培养第21天可达到794 ± 115.6倍的扩增，在第12天可达80–419倍。

K562细胞是应用最广泛的NK细胞扩增饲养细胞，并且已开发出多种基因工程改造的K562（GeK562）细胞，通过表达有助于刺激的配体来改善NK细胞扩增。表达4-1BB配体、膜结合IL-15（mbIL-15）和膜结合IL-21（mbIL-21）的GeK562细胞作为饲养细胞显示出卓越的NK细胞扩增能力。此外，还开发了表达OX40配体、膜结合IL-18和HLA-E等分子的GeK562细胞。虽然各项研究中观察到的NK细胞扩增效果存在差异，但很难仅根据扩增倍数来判断哪种GeK562更优，因为这种差异不仅源于饲养细胞的不同，还源于培养基等实验条件的差异。

其他肿瘤细胞系也通过基因工程被开发为饲养细胞，用于有效刺激NK细胞。例如，源自PC-3细胞系（前列腺癌）的饲养细胞通过基因工程表达前列腺干细胞抗原（PSCA）以及IL-2、4-1BBL和mbIL-15-mutDAP12融合蛋白。经EBV感染转化的淋巴母细胞系用作饲养细胞时，在第21天显示出490 ± 260倍的扩增，且细胞毒性功能增强。HuT 78细胞系（皮肤T细胞淋巴瘤）被系统研究以最大化NK细胞扩增倍数，其经过工程改造表达4-1BB配体、膜结合TNF-α和mbIL-21的饲养细胞在培养第21天显示出超过2,000倍的扩增。

尽管早期对基因工程饲养细胞的研究探讨了共表达mbIL-15和mbIL-21，但当前基于饲养细胞的NK细胞扩增最常采用可溶性IL-15补充与表达mbIL-21的饲养细胞相结合的方式。IL-15需要持续存在以维持NK细胞增殖，但饲养细胞在培养几天内就会被迅速清除，这意味着mbIL-15的表达效果较差。相比之下，IL-21主要在NK细胞培养的初始阶段起作用，其早期信号被证明在整个扩增过程中能产生持久效应。

基于饲养细胞的NK细胞扩增因其高扩增率而被广泛用于包括临床试验在内的NK细胞研究。然而，该方法很大程度上受饲养细胞质量的影响，因此必须严格管理饲养细胞的培养或储存条件。出于这个原因，需要开发新的NK细胞扩增方法，既能扩增NK细胞，又易于储存，以便对临床使用的扩增后NK细胞进行质量控制。

3 Feeder-free NK cell expansion

3.1 Cytokine combination

人们进行了多种研究以尝试在没有饲养细胞的情况下扩增NK细胞，其中最基础的方法是寻找最佳的细胞因子组合。根据处理时间、浓度和组合的不同，细胞因子对NK细胞扩增和功能的影响也不同。单独使用IL-15培养纯化的NK细胞，在最初10天内细胞数量显著增加，而单独使用IL-21处理则未能诱导NK细胞增殖。在NK细胞培养开始时进行短暂的IL-21处理，可增强IL-15处理下的扩增倍数，这表明IL-21本身不足以诱导NK细胞增殖，但可以与其他细胞因子协同支持NK细胞增殖。其他细胞因子组合，包括IL-2、IL-18、重组IL-27（rIL-27），也显示出改善的NK细胞扩增倍数。基本上，IL-2和IL-15是必需细胞因子，单独处理时能引起温和的NK细胞增殖。IL-18、IL-21和IL-27是辅助细胞因子，单独处理时NK细胞增殖较少，但与必需细胞因子组合时可增强NK细胞扩增倍数。用必需细胞因子与辅助细胞因子组合培养的NK细胞，在靶细胞刺激下，也显示出激活受体表达增加以及脱颗粒和IFN-?分泌等功能增强。

3.2 Antibody stimulation

在T细胞培养中，使用抗CD3/CD28抗体刺激可有效诱导增殖。类似地，在NK细胞中也进行了各种研究，试图利用激动性抗体的组合来诱导增殖而不使用饲养细胞。有趣的是，常用于T细胞增殖的抗CD3激动性抗体克隆OKT-3，在NK细胞增殖中也显示出效果。这归因于T细胞响应OKT-3刺激所分泌的细胞因子促进了NK细胞增殖。使用OKT-3刺激从PBMC培养NK细胞，显示出700倍的扩增和55%的NK细胞纯度（CD3^-/CD56⁺），这意味着仅使用OKT-3并非替代饲养细胞培养法的理想选择。使用极小剂量的OKT-3（0.001 ~ 0.01 μg/mL）和20 μg/mL抗CD52抗体的组合，改善了NK细胞扩增，纯度约为60%。另一种使用OKT-3与抗CD16激动性单克隆抗体的抗体组合，将NK细胞纯度提高至75.2 ± 16.3%，同时T细胞（CD3⁺/CD56^-）比例从66.5 ± 7.8%下降至16.5 ± 6.2%。然而，抗CD16刺激显示出广泛的供体间差异，且这种差异与抗CD16抗体克隆无关。使用OKT-3的NK细胞培养方法由于残留T细胞而限制了NK细胞纯度，因此研究了排除OKT-3的抗体组合，用于从去除T细胞的PBMCs中培养NK细胞。用抗NKp46和抗CD16抗体组合刺激去除T细胞的PBMCs，可获得超过98%的NK细胞纯度和1,000倍的扩增。其NK细胞纯度和扩增倍数均优于其他抗体组合，但培养基类型和细胞因子组合等培养试剂的差异也会影响结果。

3.3 Human blood derived components

在细胞培养中使用血清、人血清（HS）或胎牛血清（FBS）存在过敏反应风险，且其成分不明确，难以在制造过程中保持培养条件的一致性和性能。自体血浆作为培养补充物最适合无外源（Xeno-free）培养基，并能实现显著的NK细胞扩增。然而，获取足够量的血浆并不容易，因此需要研究血清成分的替代品。在干细胞衍生NK细胞培养的研究中，使用人血小板裂解物（hPL）替代人血清。在含hPL或HS的培养基中，从CD34⁺干细胞进行NK细胞分化和扩增后，两种培养基都能产生成熟NK细胞。但发现hPL能促进更大的NK细胞增殖以及CD16和NKp46等激活受体的表达，表明hPL可能有助于生成成熟且具有细胞毒性的NK细胞。另一项研究表明，含有hPL的培养基与Cloudz（一种装饰有抗CD2和抗NKp46激动性抗体的NK细胞刺激剂）联用，可用于从PBMCs扩增NK细胞。这些结果表明，NK细胞培养基中的血清可以被hPL替代，以实现无外源的NK细胞扩增方案。

3.4 Nanoparticle

纳米材料是尺寸在1纳米到200纳米之间的物质，已被广泛研究用于药物和基因递送等多种领域。纳米材料拥有其独特特性：1）能够在表面连接多价分子；2）易于通过化学偶联修饰其功能；3）能通过受体介导的内吞途径有效被靶细胞摄取。最近，纳米材料用于NK细胞扩增的研究已展开，以利用其独特优势。

其中一种策略是制备蛋白质偶联的纳米凝胶。例如，开发了包含IL-21和CD45的纳米凝胶（ILNPs），它们能够“搭便车”式地与NK细胞结合。IL-21的掺入允许在肿瘤微环境（TME）中控制激活，从而降低全身毒性并诱导IL-12介导的先天免疫激活。除了化学偶联方法，使用细胞膜衍生的纳米材料进行NK细胞扩增作为下一代方法也备受关注，因为它含有与源细胞一致的完整膜蛋白谱，支持对靶细胞蛋白的识别。Park研究小组开发了表达癌细胞膜的磁性纳米颗粒，能特异性刺激NK细胞，并作为基因递送载体诱导EGFR-CAR的表达。涂有咖啡酸、聚多巴胺和聚乙烯亚胺的多功能纳米颗粒（MF-NPs）在有效内化到NK细胞后毒性降低，并由于其基因递送能力而诱导NK细胞表面表达EGFR-CAR。

模拟饲养细胞的策略也有报道。Copik研究小组证明，饲养细胞膜衍生的颗粒可用于替代常见的基于饲养细胞的NK细胞扩增方法。当使用血浆膜颗粒（PM-particles）替代活饲养细胞时，结果显示NK细胞扩增和表型相当。类似地，Wang研究小组展示了纳米材料基NK细胞扩增的另一种应用，他们开发了细胞膜包裹的磁性纳米颗粒用于激活NK细胞并增强其抗肿瘤功效。细胞外囊泡（EVs）是细胞分泌的另一类纳米材料，含有来自原始细胞的各种特定蛋白，已被研究用于疫苗、免疫调节等应用。Chaput研究小组证明，树突状细胞来源的外泌体（Dex）具有功能性MHC/肽复合物，可作为T细胞依赖性肿瘤排斥的促进剂，并通过IL-15Rα和NKG2D信号支持NK细胞增殖和激活。

总而言之，纳米材料代表了可定制的无饲养细胞平台，能够模拟细胞间相互作用，在降低毒性的同时增强NK细胞扩增。此外，由于它们可以以明确的方式生产并在符合GMP（药品生产质量管理规范）的条件下长期储存，它们在临床转化方面充满希望，尽管仍需进一步评估其安全性、可重复性和成本。

3.5 Hydrogel

使用NK细胞的水凝胶基过继细胞疗法也已被探索，尤其针对实体瘤。水凝胶提供三维、生物相容的支架，可以将免疫细胞与支持因子一起封装其中，从而在免疫抑制性肿瘤微环境（TME）中保持其活力和抗肿瘤活性。虽然许多研究使用NK-92细胞作为模型系统，但这些方法广泛适用于基于NK细胞的疗法。

例如，封装在海藻酸钠/明胶水凝胶（ALG/GEL-2）中的NK-92细胞，与没有水凝胶培养的细胞相比，显示出更高的活力和细胞毒功能。使用PEO/ALG制造的微球具有高渗透性和高效的营养交换能力，使NK-92MI细胞在培养72小时后的存活率超过85%，活力可维持长达14天。封装的NK-92MI细胞通过分泌穿孔素和颗粒酶有效摧毁肿瘤细胞，多孔水凝胶微球进一步保护NK-92MI细胞免受免疫排斥反应，支持其存活和增殖。另一项研究通过将经过CellDex工程改造的NK-92细胞封装到基于GelMA生物墨水的水凝胶中，创建了NK-CellDex。这些水凝胶胶囊支持细胞增殖，提高活力，并保持与二维培养相似的细胞形态，表明水凝胶即使在封装后也能支持NK细胞扩增。

从机制上讲，水凝胶有助于保护NK细胞免受TME来源的抑制信号影响，同时支持持续的营养交换。它们还可以被设计用于递送刺激分子以增强NK细胞活性。重要的是，除了作为递送载体，水凝胶提供的微环境可能促进NK细胞在体内增殖，从而提供了无饲养细胞扩增策略的潜力。此外，局部和持续的NK细胞递送可以降低全身毒性并增强治疗效果。

总体而言，基于水凝胶的NK细胞递送系统代表了有前景且可转化的无饲养细胞方法。它们具有生物相容性、模块化设计和可扩展性等优势，同时也有潜力促进NK细胞扩增。然而，在临床应用之前，诸如监管批准和可重复性等挑战仍有待解决。

4 Conclusions

总之，使用细胞因子、抗体和血液来源成分的无饲养细胞策略已经推进了NK细胞扩增，但仍受限于增殖不一致和可重复性问题。尽管明确的细胞因子或抗体系统更适合临床使用，但由于NK细胞复杂的信号需求，其开发变得困难。因此，基于饲养细胞的系统仍然被广泛使用，尽管其临床转化引发了安全性和标准化方面的担忧。新兴的纳米材料和水凝胶基平台提供了符合GMP、可储存的替代方案，能够递送刺激信号、保护细胞免受免疫抑制并维持活力。这些方法代表了克服当前局限性和推进NK细胞疗法的新可能性。