冻干水平离心富血小板纤维蛋白通过调控巨噬细胞极化和成纤维细胞迁移促进感染性烧伤创面愈合

本研究发现，冻干水平离心富血小板纤维蛋白（Ly-H-PRF）可有效抑制金黄色葡萄球菌（S.a）和大肠杆菌（E.c）生长，并通过调节巨噬细胞M1/M2极化表型、减少细胞凋亡、促进成纤维细胞迁移，显著改善感染性烧伤创面的愈合过程，为临床治疗提供了经济便捷的新型生物材料方案。

　　

背景：感染性烧伤的治疗是临床面临的重要挑战。通过水平离心制备的富血小板纤维蛋白（H-PRF）已被证实具有抗菌和组织再生特性。值得注意的是，其冻干形式（Ly-H-PRF）便于保存，可能也具有类似的再生潜力。本研究旨在通过多种体外和体内模型模拟感染性烧伤/创面，探究Ly-H-PRF是否能促进创面愈合及其调控机制。

方法：研究采集健康志愿者的静脉血，经700 RCF水平离心8分钟后冻干获得Ly-H-PRF。将Ly-H-PRF溶解于培养基中，采用倾注平板法评估其对金黄色葡萄球菌（S.a）和大肠杆菌（E.c）的抗菌效果。此外，通过荧光染色和流式细胞术研究Ly-H-PRF对脂多糖（LPS）刺激后巨噬细胞细胞周期和极化的影响。还通过流式细胞术、Transwell实验和划痕实验检测Ly-H-PRF对LPS培养后皮肤成纤维细胞的影响。最后，建立小鼠二度烧伤模型，分为四组：1）PBS组，2）S.a感染组，3）S.a感染+烧伤药膏组，4）S.a感染+Ly-H-PRF组。5天后通过组织学评估研究烧伤创面组织的愈合情况、炎症细胞浸润、新生胶原组织及巨噬细胞极化。

结果：Ly-H-PRF有效抑制了S.a和E.c的生长。它还保护巨噬细胞免受LPS刺激的凋亡，减少LPS诱导的巨噬细胞M1极化并促进M2极化。Ly-H-PRF进一步保护成纤维细胞免受LPS刺激的凋亡并促进其迁移。在体内烧伤创面模型中，术后5天S.a感染导致创面扩大和溃疡加重，常规烧伤药膏的效果不如Ly-H-PRF治疗感染性创面。值得注意的是，Ly-H-PRF促进了创面愈合，减少了炎症细胞浸润，并增加了胶原合成。

结论：本研究证明Ly-H-PRF通过发挥抗菌作用、调节巨噬细胞极化及促进皮肤成纤维细胞迁移，促进感染性烧伤创面的愈合。研究结果为Ly-H-PRF作为一种经济便捷的治疗方法，用于控制感染和促进感染性烧伤创面组织愈合的临床应用提供了前期理论依据。

材料与方法

Ly-H-PRF的制备：本研究经武汉大学口腔医学院批准（MRI2023-LACA14, WDKQ 2024A28）。从六名健康志愿者（25-40岁）采集外周血于玻璃采血管中。采集的外周血在水平离心机中以700 g离心8分钟，收集上清血浆层并记录体积。然后将液态H-PRF在液氮和37°C水浴中快速冻融5次，离心去除细胞残留后冻干，获得固态Ly-H-PRF。在体外实验前，将5%的Ly-H-PRF溶解于与原体积相同的体积中用于实验，并拍照。使用扫描电子显微镜（SEM）观察Ly-H-PRF在不同放大倍数下的形态。

体外抗菌活性：采用倾注平板法测定Ly-H-PRF的抗菌活性。将20 μL Ly-H-PRF溶液与180 μL S.a或大肠杆菌（E.c）悬液（10⁷ CFU/mL）孵育24小时，记录0小时和24小时600 nm处的吸光度。孵育后，将Ly-H-PRF和细菌溶液的混合物用BHI肉汤稀释100倍，涂布于BHI琼脂平板。在37°C培养24小时后，对细菌菌落拍照计数。剩余的细菌悬液用STYO9/PI活死细菌染色试剂盒染色，并通过荧光显微镜分析。

细胞培养：RAW 264.7巨噬细胞和L929成纤维细胞在高糖DMEM培养基中培养，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素。细胞在37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。达到80%-90%汇合度时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液传代。

巨噬细胞活死检测：将RAW 264.7细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在带有15 mm直径盖玻片的12孔板中。细胞用LPS（6 μg/mL）处理，加或不加5% Ly-H-PRF，处理24小时。处理后，用PBS洗涤三次，并用Calcein/PI细胞活力和细胞毒性检测试剂盒染色。染色后在37°C孵育30分钟，再用PBS洗涤三次。盖玻片封片后，使用共聚焦显微镜拍摄图像。

巨噬细胞和成纤维细胞的流式细胞术分析：将RAW 264.7细胞和L929细胞接种在12孔板中，用LPS（6 μg/mL）处理，加或不加5% Ly-H-PRF，处理24小时。然后细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤三次，以4,000 rpm离心5分钟。细胞然后用Calcein/PI细胞活力和细胞毒性检测试剂盒染色，并在37°C孵育30分钟。孵育后，细胞用PBS洗涤三次，重悬于PBS中，使用BD Fortessa? X-20仪器进行流式细胞术分析。数据使用FlowJo 10.8.1分析。

对于细胞周期分析，将RAW 264.7细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在12孔板中，用LPS（6 μg/mL）处理，加或不加5% Ly-H-PRF，处理24小时。随后，细胞在含有Hoechst 33342的培养基中孵育90分钟。孵育后，细胞用PBS洗涤三次，重悬于PBS中，进行流式细胞术分析。

对于凋亡检测，将RAW 264.7细胞和L929细胞接种在12孔板中，用LPS（6 μg/mL）处理，加或不加5% Ly-H-PRF，处理24小时。使用APC-Annexin V/PI凋亡试剂盒染色，并在4°C孵育30分钟。染色后，细胞用PBS洗涤三次，重悬于PBS中，进行流式细胞术分析。

巨噬细胞极化检测：将RAW 264.7细胞以每孔1×10⁵个细胞的密度接种在24孔板中，用LPS（6 μg/mL）处理，加或不加5% Ly-H-PRF，处理24小时。处理后，收集细胞并用PBS洗涤三次。随后，用PE抗小鼠CD206（1:100）和FITC抗小鼠CD86（1:100）抗体染色，然后在4°C孵育30分钟。孵育后，细胞用PBS洗涤三次，重悬于PBS中，使用BD Fortessa? X-20仪器进行流式细胞术分析。使用FlowJo 10.8.1软件进行数据分析。

Transwell实验：将L929细胞饥饿处理12小时，收集后以每孔5×10⁴个细胞的密度接种到transwell板的上室中。将LPS（6 μg/mL）加或不加5% Ly-H-PRF添加到24孔transwell板的孔中。12小时后，取出上室，细胞用4%甲醛固定。用棉签去除上室上表面未迁移的细胞。细胞然后用0.5%结晶紫染色30分钟，用PBS洗涤三次，记录上室下表面的迁移细胞并在光学显微镜下计数进行统计分析。

划痕愈合实验：将L929细胞以每孔3×10⁵个细胞的密度接种在6孔板中。24小时后，用无菌3 mm直径移液器吸头制造划痕。划痕后立即（0小时）在光学显微镜下拍摄图像。细胞然后用LPS（6 μg/mL）加或不加5% Ly-H-PRF处理12小时，再次拍摄图像。迁移率计算公式为：（0小时划痕宽度 - 12小时划痕宽度）/ 0小时划痕宽度 × 100%。

体内感染性烧伤创面模型：实验方案经武汉大学伦理委员会批准。在小鼠（C57BL/6）背脊部创建感染性烧伤创面模型。小鼠通过腹腔注射戊巴比妥溶液（4%）麻醉，然后脱毛消毒。使用直径1.5 cm的圆形探头在热水中加热至100°C，应用于脱毛消毒的皮肤组织10秒，在背脊两侧各制造两个烫伤创面。24小时后去除痂皮。预先制备S.a菌液并稀释至1×10⁷菌落形成单位（cfu）/mL。将小鼠随机分为四组：PBS组（烧伤创面+PBS）、S.a组（烧伤创面+S.a）、S.a+BO组（烧伤创面+S.a+烧伤药膏）、S.a+Ly-H-PRF组（烧伤创面+S.a+Ly-H-PRF），每组六个创面。

在PBS组，烧伤创面用生理盐水浸泡的无菌纱布覆盖，然后用绷带包扎。在S.a组，将剪成创面大小的无菌纱布放在创面上，然后滴加10 μL制备的菌液，再用绷带包扎。在S.a+BO组，应用菌液后，在纱布上涂抹烧伤药膏，再用绷带包扎。在S.a+Ly-H-PRF组，应用菌液后，在纱布上添加10 μg PRF冻干粉，再用绷带包扎。创面形成后，每2天用无菌生理盐水清洁创面，用聚维酮碘消毒，然后更换新敷料。愈合率计算公式为：愈合率 = （第1天创面面积 - 第5天创面面积）/ 第1天创面面积 × 100%。

组织学分析：第五天，从每只小鼠（每组n=6只）采集创面的全层组织样本，在中性缓冲福尔马林中固定48小时，石蜡包埋。每只小鼠取一个代表性创面组织块切片制备5 μm切片。进行苏木精和伊红（HE）染色观察再上皮化和创面愈合（每只小鼠一次分析）。进行Masson三色染色观察创面部位胶原纤维的沉积（每只小鼠一次分析）。进行免疫荧光染色比较不同组创面部位巨噬细胞的极化。免疫荧光染色中，切片用1%牛血清白蛋白封闭。应用PE抗小鼠CD206（1:100）和FITC抗小鼠CD86（1:100）抗体在4°C过夜。使用荧光显微镜拍摄图像。每个免疫荧光切片分析多个视野以评估每只小鼠单个创面样本内的巨噬细胞极化。

统计分析：所有实验均使用双向Student t检验分析。对于不同样本的比较，使用非配对t检验。对于同一标本内不同处理的比较，使用配对t检验。P值小于0.05被认为具有统计学显著性。在图中，星号表示P < 0.05，P < 0.01，P < 0.001，P < 0.0001，ns = 不显著。

结果

材料照片、显微形态和溶解性：冻干后，材料形成片状结构，易于处理和使用。在SEM观察中，材料在×30,000放大倍数下呈现海绵状多孔结构。它可以整体易于处理，并易溶于PBS。

Ly-H-PRF的抗菌效果：与细菌悬液中的10% Ly-H-PRF混合物孵育24小时后，琼脂平板上的细菌菌落数量显著低于对照组，对E.c和S.a均如此。此外，孵育24小时后测量的细菌悬液吸光度值显示相同趋势，用10% Ly-H-PRF处理的悬液明显更清澈，表明细菌生长减少，差异具有统计学显著性。细菌活死染色结果进一步证实了这一点，显示10% Ly-H-PRF处理组有大量死细菌，活细菌较少。死细菌似乎聚集形成簇。

Ly-H-PRF对LPS诱导的巨噬细胞凋亡和巨噬细胞细胞周期的影响：从荧光和流式细胞术图像中观察到，与对照组相比，LPS组死巨噬细胞数量显著更高。然而，添加Ly-H-PRF显著减少了由LPS引起的这些死细胞数量，表明Ly-H-PRF可以挽救细菌内毒素诱导的巨噬细胞凋亡。此外，Ly-H-PRF刺激还显著增加了活巨噬细胞的数量，可能是由于Ly-H-PRF中的生长因子刺激了细胞增殖。

用/不用LPS和Ly-H-PRF处理24小时的RAW细胞周期和凋亡：与对照组相比，LPS组和LPS+Ly-H-PRF组均促进了巨噬细胞从G0-G1期向G2-M期的转变。LPS组与对照组相比凋亡显著增加，而LPS+Ly-H-PRF组与LPS组相比凋亡显著减少。这进一步证实了Ly-H-PRF对LPS诱导的巨噬细胞凋亡的保护作用。细胞形态染色显示三组细胞在24小时时细胞骨架形态无差异。

Ly-H-PRF对巨噬细胞极化的影响：使用流式细胞术检测巨噬细胞表面极化标记物评估Ly-H-PRF对巨噬细胞极化的影响。发现LPS刺激后，巨噬细胞上的M1标记CD86显著增加，而添加Ly-H-PRF显著降低了其水平，恢复到与对照组相似的水平。流式细胞术结果还显示LPS处理不影响巨噬细胞上M2标记CD206的表达，但Ly-H-PRF处理与LPS和对照组相比显著增加了该标记的表达。这表明PRF治疗可能通过促进M2巨噬细胞极化有助于形成促进创面愈合的免疫微环境。

Ly-H-PRF对LPS诱导的成纤维细胞凋亡和迁移的影响：进一步使用流式细胞术评估LPS刺激24小时后L929细胞的凋亡。发现与对照组相比，LPS处理后成纤维细胞凋亡率显著增加并翻倍，而Ly-H-PRF处理显著降低了该速率，几乎恢复到处理前水平。Transwell实验证明LPS处理后L929细胞的迁移能力显著降低，而Ly-H-PRF处理不仅显著挽救了其迁移能力，而且显著增加至高于处理前的水平。划痕实验结果与Transwell实验相似，表明LPS抑制了成纤维细胞的迁移能力，而Ly-H-PRF恢复了由LPS引起的受损迁移能力甚至进一步增强。

Ly-H-PRF对感染性烧伤创面愈合的影响：在小鼠感染性烧伤创面模型中，观察到烧伤创面形成后未经任何处理，5天后创面面积略有减小并有少量结痂形成。然而，在S.a组，由于感染，创面面积显著增加。在感染期间使用市售烧伤药膏治疗的组（S.a+BO组），创面面积无显著变化，并观察到一些坏死组织。相反，感染期间同时使用Ly-H-PRF治疗导致显著结痂形成，创面面积减少与未感染组相似，进一步证明Ly-H-PRF对感染性烧伤创面具有保护作用。HE染色和Masson三色染色均显示S.a组烧伤组织中有丰富的空泡结构，可能由细菌引起的组织损伤导致。在S.a+BO组，空泡结构较少，并观察到一些新形成的胶原组织。在S.a+Ly-H-PRF组，有丰富的新形成胶原纤维，观察到的空泡结构较少。PBS组观察到中度炎症细胞浸润，而S.a组观察到严重炎症细胞浸润。然而，使用烧伤药膏治疗后炎症浸润减少，尤其是在Ly-H-PRF组。

Ly-H-PRF对感染性烧伤创面模型中巨噬细胞极化的影响：在小鼠感染性烧伤创面模型中，观察到S.a组感染5天后，烧伤组织中CD86阳性细胞增加，表明感染导致巨噬细胞向M1表型极化。S.a+BO组M1巨噬细胞数量低于S.a组，并在S.a+Ly-H-PRF组进一步减少。另一方面，S.a组烧伤组织中M2巨噬细胞减少，而S.a+BO组M2巨噬细胞数量比S.a组增加，并在S.a+Ly-H-PRF组进一步增加。这表明使用Ly-H-PRF能够减少过度炎症反应并促进软组织愈合。

Ly-H-PRF促进感染性烧伤创面上皮化和血管再生：在小鼠感染性烧伤创面模型中，观察到S.a组感染5天后，S.a+BO组创面组织中上皮化标记E-钙粘蛋白的表达高于S.a组，而S.a+Ly-H-PRF组E-钙粘蛋白的表达显著高于S.a组。这表明使用Ly-H-PRF促进了感染性烧伤创面的上皮化。另一方面，S.a+BO组创面组织中CD31的表达高于S.a组，S.a+Ly-H-PRF组CD31的表达显著高于S.a组，表明Ly-H-PRF可以促进感染性烧伤创面的血管再生。

讨论

发生烫伤时，皮肤屏障受损，易受外源性病原体侵入，导致难以治疗的感染。研究表明，约42%–65%的烧伤相关死亡与感染有关。因此，开发治疗感染性烧伤创面的解决方案非常重要。

血小板浓缩物是富含生长因子和活细胞的生物材料，具有三维纤维蛋白支架。由于存在多种生长因子，它们在皮肤再生、牙科再生、运动医学、整形外科和各种烧伤病例中具有广泛应用，并表现出良好的效果。新型H-PRF在感染性烧伤创面中的应用尚未见报道。在本研究中，我们使用H-PRF并通过冻干保存，具有使用方便的优点。此外，它可以多次取样制备，从而避免了自体移植物来源不足的问题。

巨噬细胞在创面愈合、宿主免疫和免疫调节中起关键作用。它们可以极化为促炎M1型和促组织再生M2型巨噬细胞，调节不同的组织愈合过程。在烧伤创面愈合阶段，如果患者发生细菌感染，会抑制M1向M2巨噬细胞的转化，从而阻碍创面向组织重塑和再生阶段的过渡。诱导创面中M1细胞向M2细胞的转化是烧伤愈合的一个挑战。在本研究中，使用LPS刺激RAW 264.7巨噬细胞体外模拟体内炎症环境。发现LPS刺激诱导巨噬细胞凋亡并促进M1极化，而使用LY-H-PRF可逆转此表型并增加M2细胞数量。小鼠感染性烧伤创面模型也验证了这些发现。在金黄色葡萄球菌感染的烧伤模型中，用Ly-H-PRF治疗减少了这些感染性烧伤创面中M1巨噬细胞的存在并增加了M2巨噬细胞。这表明Ly-H-PRF能够改善这些同时伴有细菌感染的烧伤创面中的持续炎症，导致难以愈合的状况。与我们的结果相印证，Nasirzadeh等人也表明H-PRF可以通过将巨噬细胞极化从促炎M1表型转变为抗炎M2表型来调节炎症反应。成纤维细胞增殖和迁移在创面愈合中也起重要作用，本研究发现LPS刺激诱导L929细胞凋亡，而Ly-H-PRF粉末在这些条件下也能防止细胞死亡。此外，通过transwell和划痕实验，我们发现Ly-H-PRF还能促进成纤维细胞迁移，进一步表明其促进感染性创面组织愈合的潜力。

在本实验中，我们使用了感染S.a的烧伤模型，这是一个广泛用于研究烧伤后感染和治疗效果的模型。如先前研究证明，未经适当治疗，感染性烧伤创面可能由于免疫系统失调而继续恶化并扩大。这种免疫失调表现为局部免疫细胞功能障碍和炎症反应加剧，阻碍创面愈合过程。我们使用含有中药成分的市售烧伤药膏作为阳性对照，它能有效缓解烧伤后感染并加速创面愈合。然而，我们发现用Ly-H-PRF粉末治疗的效果更显著。这可能归因于H-PRF的强大抗菌特性，它也显著促进创面愈合。

最后，必须关键指出，离心方案、使用的管类型和用于生产PRF的医疗设备都对最大化PRF的再生潜力至关重要。在最近一项题为“优化富血小板纤维蛋白”的研究中，讨论了一系列关键特性以提升PRF在私人诊所的临床使用。讨论的一个重要特性是PRF管对PRF最终结果的影响。许多PRF管，尽管可能被宣传为“无化学添加剂”，但负载了化学添加剂如二氧化硅或硅酮，这可能对PRF的最终生产产生负面影响。

结论

本研究证明Ly-H-PRF能够发挥抗菌作用，将巨噬细胞极化从M1表型调节为M2表型，并增强皮肤成纤维细胞迁移。它还通过促进创面愈合、减少炎症细胞浸润和增加胶原合成，在治疗感染性烧伤创面方面显示出有前景的疗效。这些发现为Ly-H-PRF作为一种成本效益高且便捷的治疗方法，用于控制感染和促进感染性烧伤创面组织再生的临床应用提供了概念验证。然而，其安全性、有效性和长期结果需要进一步研究。本研究也支持进一步探索Ly-H-PRF在其他再生医学应用中的潜力。