免疫-分子关联在生殖障碍中的作用：POI与RSA的机制联系

本研究通过整合多转录组数据与机器学习算法，系统揭示了早发性卵巢功能不全（POI）和复发性自然流产（RSA）的共同分子机制，鉴定出CENPW、ENTPD3、FOXM1、GNAQ、LYPLA1和PLA2G4A六个核心基因，并发现其与核糖体通路、氧化磷酸化和类固醇生物合成等关键通路密切相关。研究进一步通过免疫浸润分析发现NK细胞、记忆CD4+ T细胞等免疫细胞亚群比例异常，并筛选出靶向这些基因的潜在治疗药物（如Coumestrol和Calcitriol），为POI和RSA的精准诊断和靶向治疗提供了新视角。

　　

1 引言

不孕症是全球范围内普遍存在的健康问题，其中早发性卵巢功能不全（POI）和复发性自然流产（RSA）是女性不孕的常见原因。尽管医学研究不断进步，约50%的RSA病例仍属特发性，且POI的发病机制复杂不明。研究表明，POI与RSA之间存在激素和免疫层面的联系，例如RSA患者中抗穆勒氏管激素（AMH）水平降低和窦卵泡计数（AFC）减少，以及CD16^?CD56⁺ NK细胞亚群的共同异常。此外，遗传因素如罗伯逊易位和卵母细胞特异性基因突变也被认为与两种疾病相关。然而，当前关于POI和RSA共病基因的生物信息学研究存在显著局限，包括依赖单一数据集和缺乏多组学整合，导致结果鲁棒性不足且临床转化价值有限。因此，本研究旨在通过整合多转录组数据和机器学习算法，系统探索POI与RSA的共同分子机制，鉴定关键枢纽基因和潜在治疗药物，为这两种疾病的精准诊断和治疗提供新见解。

2 材料与方法

2.1 研究对象

研究选取2023年至2024年期间在江苏大学附属第四医院生殖医学中心接受体外受精（IVF）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）辅助妊娠的30例POI患者和10例因输卵管和/或男性因素接受治疗的对照组患者，收集颗粒细胞；同时选取15例因复发性流产接受流产手术的患者和10例无不良孕产史的对照组患者，收集子宫内膜组织。排除标准包括近3个月内使用类固醇药物、子宫器质性病变、自身免疫疾病史以及放疗或化疗史。

2.2 方法

2.2.1 数据收集与准备

从基因表达综合数据库（GEO）中筛选POI和RSA相关数据集。对于RSA，使用关键词“RSA”或“子宫内膜组织”搜索基因表达谱，最终纳入五个数据集（GSE180485、GSE183555、GSE165004、GSE111974和GSE26787）。对于POI，筛选条件包括包含正常对照和POI患者，且样本来源为颗粒细胞，最终纳入两个数据集（GSE232306和GSE201276）。

2.2.2 差异基因表达分析

使用“sva”R包去除批次效应，并利用LIMMA包进行差异表达基因（DEGs）分析。对于RSA和POI，设定P值<0.05为差异表达阈值，并通过主成分分析（PCA）验证批次效应校正效果。使用火山图和维恩图展示差异表达基因。

2.2.3 GO和KEGG分析

使用“clusterProfiler”包对DEGs进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，显著阈值设为P<0.05。GO分析包括生物过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。

2.2.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络与枢纽基因筛选

使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并通过Cytoscape的CytoHubba插件和MCODE算法识别枢纽基因。使用GeneMANIA进行基因功能关联网络分析。

2.2.5 转录因子与TF-miRNA调控网络

利用NetworkAnalyst 3.0平台和ENCODE数据库预测枢纽基因的潜在转录因子（TFs），并构建TF-基因和TF-miRNA调控网络。

2.2.6 机器学习算法特征选择

采用三种机器学习算法（LASSO、随机森林和SVM-RFE）筛选特征基因。通过交叉验证确定最优模型，并取三种算法的交集基因作为候选诊断基因。

2.2.7 诊断列线图构建与验证

使用“rms”R包构建诊断列线图，并通过校准曲线、决策曲线分析（DCA）和受试者工作特征（ROC）曲线评估其诊断效能。

2.2.8 基因集富集分析

使用MSigDB数据库下载基因集，并通过ssGSEA算法计算基因集变异分析（GSVA）得分，展示枢纽基因相关的前五个激活和抑制通路。

2.2.9 免疫细胞浸润分析

使用CIBERSORTx工具基于基因表达数据估计22种免疫细胞亚群的比例，并通过Pearson相关分析评估免疫细胞类型之间的关系。

2.2.10 枢纽基因与免疫相关性分析

通过Pearson相关系数评估枢纽基因与免疫细胞浸润及免疫检查点分子的相关性。

2.2.11 药物靶向GSEA富集分析

利用DSigDB数据库进行药物-基因相互作用富集分析，筛选靶向枢纽基因的潜在治疗药物，显著阈值设为P<0.05且药物靶点≥2。

2.2.12 基因验证

使用KGN细胞系构建氧化应激模型，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）验证枢纽基因的表达水平。GAPDH作为内参基因。

2.2.13 统计分析

数据以均值±标准误表示，使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。组间差异采用非配对t检验，显著性水平设为P<0.05。

3 结果

3.1 差异表达基因鉴定与功能富集分析

在POI数据集中共鉴定出3449个DEGs（1782个上调，1667个下调），在RSA数据集中鉴定出1596个DEGs（686个上调，910个下调）。通过比较两个数据集，共发现136个共同DEGs（93个上调，43个下调）。GO富集分析显示，这些DEGs显著富集于胆固醇生物合成过程等生物过程；KEGG分析显示，它们主要参与代谢通路和嘌呤代谢等通路。

3.2 蛋白质-蛋白质相互作用与枢纽基因识别

通过PPI网络和CytoHubba插件，鉴定出23个共同DEGs，并与MCODE分析结果取交集，得到19个共享基因。GeneMANIA分析显示，这些基因主要与免疫应答调节、有丝分裂核分裂和染色体着丝粒区域等功能相关。

3.3 基于机器学习算法的共享诊断基因鉴定与实验验证

使用三种机器学习算法（LASSO、SVM-RFE和随机森林）筛选出六个共享诊断基因：CENPW、ENTPD3、FOXM1、GNAQ、LYPLA1和PLA2G4A。通过qRT-PCR验证，这些基因在POI患者颗粒细胞和RSA患者子宫内膜组织中的表达模式与数据分析结果一致。

3.4 转录水平调控网络构建与诊断列线图验证

构建了TF-基因和TF-miRNA调控网络，涉及25个转录因子、6个枢纽基因和41条边，以及61个miRNA和22个TF基因。诊断列线图显示校准曲线与实际风险接近，DCA和ROC曲线表明列线图具有良好的诊断效能。

3.5 诊断基因的效能与外部验证

ROC曲线分析显示，六个枢纽基因在POI和RSA中均具有较高的诊断价值（AUC值介于0.603至0.947之间），表明它们可作为可靠的生物标志物。

3.6 诊断基因的GSEA分析

GSEA分析显示，CENPW、GNAQ、LYPLA1和PLA2G4A与核糖体通路相关；ENTPD3与氧化磷酸化、核糖体和类固醇生物合成通路相关；FOXM1参与碱基切除修复、细胞周期和DNA复制通路。

3.7 免疫浸润评估与可视化分析

CIBERSORTx分析发现，POI样本中静息记忆CD4 T细胞和单核细胞比例升高，而RSA样本中幼稚B细胞和γδ T细胞比例降低。相关分析显示，免疫细胞类型之间存在显著的正负相关性。

3.8 枢纽基因与免疫指标的相关性

枢纽基因与免疫细胞浸润及免疫检查点分子显著相关。例如，在POI中，CENPW与静息记忆CD4 T细胞呈负相关；在RSA中，PLA2G4A与浆细胞正相关，与活化NK细胞负相关。

3.9 候选药物鉴定

通过药物靶向富集分析，筛选出12种候选药物，其中Coumestrol和Calcitriol可靶向多个枢纽基因。分子对接模拟显示，这些药物与靶点基因具有较高的结合亲和力和特异性。

4 讨论

本研究通过多组学数据整合和机器学习算法，鉴定出POI和RSA的六个关键枢纽基因（CENPW、ENTPD3、FOXM1、GNAQ、LYPLA1和PLA2G4A），并揭示它们与核糖体通路、氧化磷酸化和类固醇生物合成等关键通路的密切关联。免疫浸润分析发现，POI和RSA患者存在独特的免疫细胞谱异常，如NK细胞和记忆CD4 T细胞比例变化。此外，筛选出的候选药物（如Coumestrol和Calcitriol）为靶向治疗提供了新方向。这些发现不仅深化了对POI和RSA共病机制的理解，也为临床诊断和治疗策略的开发奠定了理论基础。未来研究需扩大样本量、进行前瞻性临床验证，并拓展至多组学层面，以进一步推动研究成果的临床转化。