邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯（MEHP）通过诱导巨噬细胞炎症反应与线粒体代谢重编程间接抑制Leydig细胞类固醇生成的体外机制研究

本研究揭示了环境污染物MEHP通过诱导巨噬细胞（RAW 264.7）线粒体代谢重编程（OCR↓/ATP↓/ΔΨm↑）、激活p38 MAPK通路并促进TNF-α分泌，进而抑制Leydig细胞（MA-10）类固醇生成（孕酮↓/STAR蛋白↓）的免疫代谢交叉对话机制，为阐明邻苯二甲酸盐生殖毒性的间接免疫介导途径提供了新视角。

　　

引言

邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）作为一种广泛使用的工业增塑剂，其活性代谢物单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP）已被证实具有内分泌干扰和生殖毒性。既往研究多聚焦于MEHP对Leydig细胞的直接毒性作用，然而其通过免疫细胞（尤其是巨噬细胞）间接影响类固醇生成的机制尚不明确。巨噬细胞作为先天免疫系统的核心组分，通过调节睾丸内细胞因子环境参与Leydig细胞功能调控。本研究通过体外实验体系，深入探讨MEHP对巨噬细胞功能的影响及其与Leydig细胞类固醇生成抑制的潜在关联。

材料与方法

使用小鼠巨噬细胞系RAW 264.7和小鼠Leydig肿瘤细胞系MA-10。MEHP处理浓度梯度设置为10-300 μM（涵盖人体暴露水平至毒理学研究浓度），通过MTT法评估细胞活性。采用流式细胞术分析细胞形态（FSC/SSC）、活性氧（ROS）生成（DCFH-DA/MitoSOX? Red）、线粒体质量（MitoTracker Green）和线粒体膜电位（JC-1染料）。Western blot检测磷酸化p38（phospho-p38）和类固醇生成急性调节蛋白（STAR）表达。ATP生成速率通过Seahorse XFp实时ATP速率分析试剂盒测定。线粒体生物发生通过In-Cell ELISA（COX-1/SDH-A比值）评估。TNF-α和孕酮分泌分别采用ELISA试剂盒定量。

结果

MEHP诱导巨噬细胞形态学改变与活化特征

MEHP处理24小时后，RAW 264.7细胞出现剂量依赖性的细胞增大（FSC增加）和细胞内颗粒度升高（SSC增加），提示细胞活化与内部结构复杂性增强。

MEHP触发氧化应激与线粒体超氧化物生成

流式细胞分析显示，MEHP暴露显著提升DCF荧光强度（H₂O₂生成）和MitoSOX Red荧光（线粒体超氧化物），表明细胞内和线粒体源性ROS水平显著升高。

ROS介导p38 MAPK通路激活

Western blot分析证实MEHP（300 μM）处理30分钟即可显著诱导p38磷酸化。外源性H₂O₂（10-100 μM）处理可模拟该效应，验证了ROS-p38信号轴在MEHP诱导的炎症应答中的核心作用。

线粒体功能紊乱与代谢重编程

Seahorse分析显示MEHP显著降低基础氧消耗速率（OCR）和线粒体ATP产量，但增加线粒体膜电位（ΔΨm）。JC-1染色显示高极化细胞群比例上升，符合糖酵解主导的代谢表型特征。

线粒体生物发生与质量增加

MitoTracker Green荧光强度和COX-1/SDH-A比值同步上升，结合显微镜下观察到的线粒体数量增多，证实MEHP促进线粒体生物发生。

MEHP促进TNF-α分泌并抑制Leydig细胞类固醇生成

ELISA检测显示RAW 264.7细胞在MEHP刺激下TNF-α分泌显著增加（100-300 μM）。该巨噬细胞源性TNF-α（1-10 ng/mL）预处理MA-10细胞后，显著抑制LH刺激的孕酮合成，并下调STAR蛋白表达，且不影响细胞活力。

讨论

本研究系统阐明了MEHP通过诱导巨噬细胞代谢与功能重编程间接抑制Leydig细胞类固醇生成的双重毒性机制。MEHP触发巨噬细胞线粒体氧化应激（ROS↑）、激活p38 MAPK信号通路，驱动其向促炎表型极化（TNF-α↑）。巨噬细胞源性TNF-α进而抑制Leydig细胞STAR表达与孕酮合成。这一免疫代谢交叉对话机制为理解环境污染物生殖毒性的非细胞自主效应提供了新范式，同时提示睾丸巨噬细胞可能是干预phthalate介导内分泌紊乱的潜在靶点。