基于粪便微生物组年龄鉴定与亲缘关系分析揭示东北虎家系谱系构建及其保护意义

本研究创新性地结合16S rRNA测序和宏基因组分析，从圈养东北虎粪便样本中鉴定出16个年龄特异性微生物标志物（如f_Erysipelotrichaceae_Unclassified和Paraclostridium），并成功应用于野生个体的年龄推断。通过整合微卫星标记（microsatellite） kinship analysis，构建了更精确的野生东北虎家系谱系，为濒危物种的非侵入性年龄鉴定和种群遗传管理提供了新范式。

　　

1 引言

随着气候变化加速导致前所未有的生物多样性丧失，威胁生态系统稳定和人类可持续发展，制定强有力的保护策略变得至关重要。谱系重建作为理解野生动物种群结构和遗传多样性的关键研究领域受到广泛关注。然而，在自然环境中建立可靠谱系面临巨大挑战，特别是对于直接观察受限或长期监测不切实际的物种。微卫星标记（microsatellite markers）因其高多态性和孟德尔遗传模式，已成为谱系重建的有力工具。但当年信息不完整或不可用时，该方法有效性大打折扣，可能导致错误的谱系分配和有偏的种群参数估计。为减少对动物的伤害和降低人为干扰，非侵入性年龄鉴定方法已成为保护遗传学的重要研究前沿。

宿主与微生物的共生关系贯穿动物生命的全过程；特别是作为动态变化的"微生物器官"，肠道菌群在群落结构和功能方面表现出与宿主年龄显著的共进化特征。先前研究表明，肠道微生物核心属的多样性和丰度随宿主生命周期有规律地波动，这种时间调控模式在人类、模式动物甚至野生动物中均保守存在。潜在机制涉及多种因素，如年龄相关的免疫衰老、肠道屏障功能变化和饮食结构改变，使得肠道菌群成为记录宿主生理时间的"生物记录器"。通过高通量测序分析粪便样本的微生物组成，可以识别与特定年龄阶段相关的微生物标记，为野生动物年龄鉴定提供高效非侵入性方法。

传统年龄鉴定方法通常依赖于分离的牙齿或骨骼样本。这些方法具有侵入性，可能对动物造成应激或伤害，且严重依赖个体自然死亡或偶然样本收集，限制了其在实际保护工作中的应用。即使与其他非侵入性技术（如擅长重建迁移历史和定义生态位的毛发同位素分析）相比，粪便微生物组分析展现出独特优势：完全避免直接干扰动物，同时捕获多维度的年龄相关生理变化，提供具有更高信息分辨率和更广功能维度的生物标志物组合。

东北虎（Panthera tigris altaica）作为顶级捕食者，在维持森林生态系统平衡和支持生物多样性方面发挥着至关重要的作用。然而，由于栖息地丧失、猎物减少、偷猎和人类活动，其个体数量逐渐下降，导致种群碎片化、近亲繁殖和灭绝风险增加。特别值得注意的是，野生东北虎种群普遍缺乏详细的谱系数据，严重制约了保护遗传管理工作的有效开展。因此，亟需进行谱系分析以促进东北虎的保护和恢复。

2 材料与方法

2.1 研究对象与样本收集

为确保充分的生物学重复，从动物园收集圈养东北虎新鲜粪便，所有个体的主要饮食包括鸡肉、牛肉和猪肉。从亚成年个体（2-3岁）、成年个体（4-9岁）和老年个体（10岁以上）中每组选取10个样本。所有圈养东北虎健康状况良好，采样前3个月未使用抗生素，样本保存于-80°C冰箱用于下游16S rRNA测序实验。同时，从每个年龄组随机选择3个个体样本进行宏基因组分析。

野生东北虎粪便样本采集自中国老爷岭景观核心区域，研究区域限制在18,029 km2，覆盖了中国大多数野生东北虎的空间分布。在该区域，基于三种不同方法进行综合粪便样本收集：样线调查、个体追踪以及当地林业局或保护区送样。来自俄罗斯西南Primorye地区豹地国家公园的遗传数据从已有研究获取。在中国收集的粪便样本经过物种扩增、微卫星个体鉴定和确认雄性东北虎的性别鉴定后，进行16S rRNA测序，同时结合俄罗斯遗传数据的微卫星数据用于构建东北虎家系。

2.2 16S rRNA测序与分析

使用DNA提取试剂盒（HiPure Stool DNA Kit）从粪便样本中提取总DNA。使用MetaVx?文库制备试剂盒提供的引物F（5′-CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT-3′）和R（5′-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3′）扩增V3-V4区域并测序。使用Illumina Novaseq平台进行二次PCR扩增，将包含独特index的连接子连接到16S rRNA基因扩增子上以实现多重下一代测序。进行双端测序生成正向和反向读长，随后合并为全长序列。质量过滤过程中去除拼接结果中含N的序列，仅保留长度超过200 bp的序列用于下游分析。使用VSEARCH（v1.9.6）以97%相似度阈值进行序列聚类，然后与Silva 138参考数据库比对进行分类学分类。使用核糖体数据库程序分类器贝叶斯算法分析操作分类单元（OTUs）的代表性序列，统计每个样本在不同物种分类水平上的群落组成。

使用R语言（v4.3.2）中的picante包计算α多样性指数，包括ACE、Chao1、Shannon和Simpson。对于β多样性分析，应用偏最小二乘判别分析（PLS-DA）检查群落组成的组间变异。使用LEfSe（v1.0）识别跨分类水平差异丰富的细菌类群，线性判别分析（LDA）得分>2.0且p<0.05设为显著性阈值。使用STAMP（v2.1.3）筛选属水平显著差异的菌属。

2.3 宏基因组测序与分析

使用Covaris S220聚焦超声破碎仪将约200 μg提取的DNA破碎至300-350 bp的平均大小范围。使用DNA清洁磁珠选择合适大小的接头连接DNA片段。每个样本使用P5和P7引物进行PCR扩增，使用Agilent 2100 Bioanalyzer验证扩增子。合格文库在Illumina Novaseq系统上进行PE 150双端测序。

使用Cutadapt（v1.9.1）对原始测序读长进行接头修剪。随后使用BWA-MEM算法（v0.7.12）默认参数将读长与宿主比对去除宿主来源序列。使用MEGAHIT（v1.13）和多k-mer大小进行全基因组从头组装。选择具有最大N50的Scaffold最佳组装结果进行基因预测分析。整合所有样本的基因序列，使用序列聚类软件MMseq2进一步消除冗余，获得非冗余单基因集，默认参数设置为90%同一性和95%覆盖率。

使用Diamond（v0.8.15.77）软件在KEGG、CAZy和CARD数据库中搜索单基因的蛋白质序列，并进行功能注释。使用LEfSe识别组间显著差异的KEGG通路。使用Omicstudio对前30种CAZymes进行聚类热图分析。使用R语言（v4.3.2）中的picante包计算基于CARD数据库鉴定的抗生素抗性基因（ARGs）的α多样性指数，包括Chao1和Simpson。使用Wekemo Bioincloud工具绘制前20种ARGs的丰度热图。

2.4 生物标志物鉴定

利用16S rRNA测序数据研究不同年龄组圈养东北虎的细菌多样性，选择在超过两个个体中独特且持续存在的属作为潜在年龄标志物。

2.5 亲缘关系分析与家谱建立

使用QIAamp Fast DNA Stool Mini kit从野生粪便样本中提取DNA。所有样本使用物种特异性引物Pta-CbF/Pta-CbR进行物种鉴定扩增。确认为老虎的样本随后进行18个多态性微卫星位点（FCA5、FCA32、FCA43、FCA44、FCA69、FCA77、FCA90、FCA94、FCA105、FCA161、FCA176、FCA211、FCA220、FCA290、FCA293、FCA304、FCA310和FCA391）的多重PCR扩增，使用荧光标记引物进行个体基因分型。最后应用引物ZFX-PF/ZFX-PR和DBY7-PF/DBY7-PR确定每个样本的性别。

为获得准确谱系结果，使用不同算法确认个体间亲缘关系。第一阶段，使用CERVUS（v3.0）生物软件进行亲本分配分析：首先分析获得的微卫星数据的基因频率，然后根据Kalinowski等方法设置模拟参数，从30个候选亲本模拟10,000个后代，亲本采样比为0.55，基因型比为0.9595，基因型错误率为1%，LOD置信评估为宽松（>80%）和严格（>95%）。随后将等位基因频率和模拟结果两个文件加载到软件中进行性别未知亲本分配分析。结合可获得的东北虎个体性别信息，排除同性别亲本家庭以及置信水平低于80%的家庭。

第二阶段分析使用Coancestry软件，包含七种不同方法（TrioML、Wang、LynchLi、LynchRd、Ritland、QuellerGt和DyadML）计算亲缘值。通过执行模拟分析从可用方法中选择最适合研究种群的方法。具体聚焦四种基本亲缘关系：亲本-后代（全同胞）、半同胞（包括祖父母-孙辈关系）、堂表和无关个体，使用观察到的微卫星等位基因频率对每个亲缘类别进行2,000次模拟。然后将模拟值与实际亲缘值比较，确定产生最小方差的方法（TrioML）作为最可靠方法。应用此选择方法计算研究种群内个体间实际观察到的亲缘值。整合两阶段结果并进一步筛选亲缘关系结果后，获得未知年龄个体的家谱重建。最后结合第2.4节鉴定的年龄信息，生成野生东北虎种群的家系谱系图。

3 结果

3.1 东北虎肠道菌群动态

通过16S rRNA测序共获得9,413,830条高质量测序读长，随后聚类为496至1,646个OTUs。经过分类学分类，序列成功注释到20个不同的门，主要类群为厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、 fusobacteriota、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）。在属水平，亚成年、成年和老年组分别鉴定出360、303和398个属。值得注意的是，老年组特有属数量最多，总计93个，而亚成年和成年组分别有30和23个独特属。粪便微生物组分析显示 Fusobacterium、 Bacteroides、 Peptoclostridium、 Collinsella、 Ruminococcus_gnavus_group 和 Escherichia-Shigella 是东北虎中的优势属。α多样性分析显示，亚成年、成年和老年东北虎的微生物丰富度（Chao1和ACE指数）和多样性（Shannon和Simpson指数）无显著差异（p>0.05）。然而，PLS-DA分析证明三个年龄组肠道菌群存在明显聚类模式。

LEfSe分析（LDA>2且p<0.05）揭示了跨年龄组的独特微生物特征。其中，成年组中 f_Sutterellaceae、 g_Sutterella 和 g_Lachnoclostridium 的相对丰度高于亚成年组。老年组中 c_Bacilli、 g_Solobacterium 和 o_Oceanospirillales 等细菌的相对丰度高于成年组，而成年组中 f_Geodermatophilaceae、 g_Roseburia、 g_Sutterella 和 g_Lachnoclostridium 等微生物的相对丰度显著高于老年组。在STAMP分析中，三个年龄组中7个属的相对丰度观察到显著差异（p<0.05）。具体而言， Solobacterium 在老年组中显著富集，而 Sutterella、 Roseburia 和 Lachnoclostridium 在成年组中表现出显著增加。

3.2 基于宏基因组的三个年龄组功能谱

宏基因组测序每个样本生成≥74,849,246条原始读长，每个样本平均有119,335条高质量组装序列，所有样本的N50值范围在1,672至3,249 bp之间。使用KEGG对组装的宏基因组数据进行功能注释显示，碳水化合物代谢相关基因是代谢通路中最丰富的功能类别。LEfSe分析揭示了年龄特异性代谢通路富集，老年组中半胱氨酸和蛋氨酸代谢、苯丙烷生物合成和氰基氨基酸代谢显著富集（LDA>2且p<0.05）。

CAZymes分析在年龄组中鉴定出41,963个基因，主要是糖苷水解酶（GH）（17230）和糖基转移酶（GT）（16109）。前30种CAZymes分析揭示了年龄特异性富集：老年组显示GHs（GH0、1、2、3、18、20、29、32、65、92）和GTs（GT2、4、5、8、28）增加，而亚成年和老年组与成年组相比均表现出更高的碳水化合物结合模块（CBMs）（CBM13,48,50）和GHs（GH13、23、39、73）。

基于CARD数据库在样本中鉴定出852个抗生素抗性基因（ARGs）。α多样性分析显示三组间Chao1和Simpson指数无显著差异（p>0.05）。热图显示前20种ARGs的丰度在三个年龄组间不同，老年组中的ARGs显著多于亚成年和成年组，成年组中最少。

3.3 微生物作为年龄预测标志物

16S rRNA测序数据分析揭示了圈养东北虎中年龄相关的细菌标志物。有16个属既独特又持续存在于超过两个个体中，这些被选为潜在年龄标志物。具体而言， f_Erysipelotrichaceae_unclassified 细菌仅在老年组粪便样本中检测到，而 Paraclostridium 独特存在于成年组。值得注意的是，这两种细菌类群也在野生东北虎中被鉴定出。

3.4 家系构建

基于从样本获得的微卫星数据，18个位点中有4个（FCA5、FCA77、FCA211和FCA391）因扩增失败或低多态性被排除。结合俄罗斯数据，共有30个个体（中国21个，俄罗斯9个）在14个微卫星位点进行了基因分型。

使用CERVUS和Coancestry，评估了遗传关系并识别了野生东北虎中潜在的亲本对。通过整合已知性别信息，重建了初步家系谱系，揭示了八个推定家庭组。在该谱系中，仅IND04、IND14、IND16和IND19可获得肠道菌群测序数据。值得注意的是，IND12进入村庄并对人类进行攻击，根据其身体特征估计为亚成年个体。IND06和IND27由于样本质量控制失败或无粪便样本而缺乏相应数据。进一步结合年龄信息分析显示， f_Erysipelotrichaceae_Unclassified 存在于个体IND14和IND19中，表明这些个体是老年个体。基于此，IND14和IND19很可能是IND07和IND12的父母。此外， Paraclostridium 仅在IND16中检测到，识别该个体为成年个体，因此IND08很可能是父本IND16和其母本IND01的后代。

4 讨论

4.1 东北虎肠道菌群中年龄相关变化的微生物组

人类和各种动物种群的肠道微生物群落会随年龄发生显著变化。通常，随着生物年龄增加，衰老可能富集更多致病菌（如肠杆菌科），而与老年人相比，成年人可能拥有更多有益菌（如 Faecalibacterium、 Bacteroidaceae 和 Lachnospiraceae）。与此一致，本研究发现东北虎存在类似变化模式：基于16S rRNA数据，β多样性分析揭示了不同年龄组东北虎肠道菌群群落显著分离。具体在属水平，我们鉴定出 Solobacterium 在老年个体中比成年个体显著更丰富。 Solobacterium moorei 是该属中唯一物种，2000年首次从人类粪便中分离，被认为是与牙龈炎、口臭和其他口腔疾病相关的病原体。作为机会致病菌，其在老年东北虎中的显著富集可能表明衰老可能影响微生物群落稳定性，增加潜在机会致病菌定植风险。同时，我们还发现有益菌，如 Lachnoclostridium 和 Roseburia（毛螺菌科），在成年东北虎中显著富集。这些细菌产生短链脂肪酸，增强肠道屏障完整性，调节葡萄糖、胆固醇和脂质代谢；支持免疫调节、抗炎反应、能量摄入和血压控制。这进一步表明肠道菌群组成可能在不同生命阶段表现出功能差异，潜在地影响机体整体健康。然而，值得注意的是，三个年龄组间肠道菌群α多样性未观察到显著差异。这可能归因于有限样本量。未来研究计划纳入更多样本以验证和扩展发现。此外，圈养东北虎在亚成年、成年和老年阶段维持一致的饮食模式，提供连续稳定的营养供应，可能减轻年龄对微生物组成的潜在影响，从而导致组间多样性无显著差异。

4.2 不同年龄东北虎肠道菌群的功能差异

动物模型研究表明，限制饮食半胱氨酸和蛋氨酸摄入可通过减缓衰老过程、改善葡萄糖和脂质代谢以及降低氧化应激水平来减少衰老相关疾病的发生。宏基因组KEGG通路分析显示，老年东北虎的半胱氨酸和蛋氨酸代谢通路显著富集，这与上述研究中过量摄入这些氨基酸可能加速衰老的报告一致。基于这些发现，我们推测老年东北虎这些代谢通路的异常活动可能促进衰老相关疾病发展，不利于健康衰老。因此，建议调节老年老虎的蛋氨酸和半胱氨酸摄入以支持更健康衰老。

已知糖基转移酶（GTs）在葡萄糖代谢通路中起重要调节作用，影响代谢速率和平衡。糖苷水解酶（GHs）主要负责分解食物中的苷类化合物，促进碳水化合物吸收。CAZy功能分析在东北虎粪便样本中鉴定出41,963个CAZyme基因，其中GH和GT家族最丰富。通过比较分析发现，与成年个体相比，大多数GTs在老年东北虎中上调，而GHs（GH13、23、39、73）在亚成年和老年个体中均显示表达增加。这些结果表明老年老虎中GTs的上调可能与维持增加的能量需求有关，而亚成年和老年老虎中GHs的高表达可能反映了不同生长阶段对营养吸收的差异需求。这些发现不仅验证了碳水化合物代谢酶在动物生长发育中的重要作用，也为理解东北虎年龄相关代谢特征提供了新的实验基础。

ARGs积累据报道与年龄呈正相关。研究发现人类肠道菌群中ARGs的数量和复杂性随年龄增加。在大熊猫中也观察到类似现象，ARGs的数量和多样性也随年龄增加。本研究在东北虎中发现类似趋势：从亚成年到成年阶段，ARGs数量逐渐减少，而从成年到老年，ARGs数量呈现增加趋势，其中前20种ARGs在老年组特别丰富。该结果进一步证实了ARGs在老年动物中积累的普遍性。值得注意的是，我们发现亚成年东北虎中ARGs的丰度和多样性甚至高于成年个体，这可能与从幼体到亚成年过渡期间的饮食变化和不完全发育有关。这些发现表明高流行率的ARGs可能对圈养东北虎的管理和保护构成挑战，特别是需要更多关注亚成年和老年个体。然而，这种现象背后的确切机制需要进一步研究和验证。

4.3 东北虎年龄特异性标志物的鉴定

理解哺乳动物年龄结构对于研究种群动态、繁殖和存活率至关重要，这些是评估生态系统健康和稳定性的关键。大量研究证实Erysipelotrichaceae细菌与人类代谢紊乱和炎症性疾病相关，如肥胖、炎症性肠病、结直肠癌等。在啮齿动物和鸟类等动物模型中，其丰度随年龄增加，表明其作为物种间保守的年龄相关微生物标志物的作用。此外， Paraclostridium 作为具有发酵和蛋白水解活性的环境适应性细菌，其生态功能已在多种哺乳动物胃肠道环境中得到证实。研究发现圈养东北虎的肠道菌属 f_Erysipelotrichaceae_Unclassified 特异性存在于老年个体中，这进一步支持了该科作为衰老生物标志物的潜力。而且， Paraclostridium 仅在成年东北虎中表达，这可能与其稳定的高蛋白饮食需求和相对固定的饲养环境有关，反映了肠道菌群对宿主代谢和免疫功能变化的适应性调整。这些年龄特异性微生物标志物的发现不仅为野生东北虎种群年龄结构评估提供了新技术手段，也为理解食肉动物肠道菌群与宿主发育的共进化关系提供了重要线索。

4.4 野生东北虎家系谱系的建立

本研究利用微卫星数据分析遗传关系并构建野生东北虎家系谱系。然而，缺乏精确年龄信息，所有个体既被视为候选亲本又被视为后代，可能影响结果准确性。为解决此问题，通过分析已知年龄圈养东北虎粪便样本的肠道菌群识别年龄特异性标志物，实现野生个体年龄估计。整合这些发现与微卫星数据提高了家系谱系重建准确性。值得注意的是，IND12被观察到进入村庄并表现出对人类攻击行为，根据其体型和形态特征推断为亚成年个体。同时，IND06和IND27由于样本质量控制失败或无粪便样本而缺乏相应数据。尽管这些缺失数据可能在一定程度上限制谱系边界的精确划定，但通过整合多源信息（包括系统发育关系分析、性别鉴定和可获得的年龄相关微生物标志物）提高了推论的合理性。未来更完整的样本和更准确的个体年龄数据将有助于进一步验证和优化此初步谱系结构。

然而，本研究仍存在若干局限性。首先，受样本可用性限制，所有分析仅在雄性个体中进行。鉴于性别因素对肠道菌群有显著影响，当前发现包括年龄相关微生物模式和健康风险指标仅适用于雄性东北虎。未来研究应纳入雌性个体以探索性别相关影响肠道菌群的机制并评估当前结论的普适性。其次，由于系统收集野生样本的挑战，本研究使用在受控饲养条件下维持的圈养种群建立了年龄与肠道菌群的基线关系。然后将此基线应用于野生个体，未来努力应旨在扩大样本量并采用多组学方法以更好地理解肠道菌群与老虎健康之间的因果关系。

5 结论

总之，我们整合16S rRNA测序和宏基因组数据，全面表征了东北虎不同生命阶段的肠道菌群和功能变化。研究揭示亚成年和老年老虎表现出更相似的微生物谱和更高的细菌抗生素耐药风险。还识别了特定肠道菌群指标可作为评估野生东北虎生物年龄的生物标志物。利用微卫星标记技术，成功建立了野生东北虎谱系，并使用年龄相关数据准确识别了个体间关系。本研究为东北虎保护管理建立了新的科学基础，提供了可应用于其他濒危物种保护的宝贵见解。