健康与缺血小鼠心脏中蛋白质乳酸化修饰的全面表征及其在心肌梗死中的功能意义

本综述系统阐述了蛋白质乳酸化修饰（Kla）在生理及心肌梗死（MI）状态下的动态变化与功能机制。研究通过乳酸化组学与蛋白质组学整合分析，首次绘制小鼠心脏乳酸化修饰图谱，揭示MI后代谢重编程（糖酵解增强、氧化磷酸化抑制）驱动乳酸水平上升，进而调控代谢酶（如CS、PFKL）、细胞骨架蛋白（如MYH6）和RNA结合蛋白（如DDX5）的乳酸化修饰，为心血管疾病治疗提供新靶点。

　　

1 引言

心肌梗死（MI）是因冠状动脉长期缺血导致的常见疾病，仍是全球主要死亡原因之一。冠状动脉闭塞显著降低心肌细胞供氧，导致氧化磷酸化减少和糖酵解速率增强。这种代谢转变引起乳酸产量增加，与临床和动物研究中报道的MI后循环乳酸水平升高一致。乳酸不仅仅是糖酵解的副产品，除了作为心肌细胞的重要能量来源外，还在维持稳态和支持各种生理功能中起关键作用。更值得注意的是，乳酸可作为表观遗传修饰的底物，从而影响基因转录和蛋白质功能。蛋白质赖氨酸L-乳酸化（Kla），或称乳酸化，是最近发现的一种蛋白质翻译后修饰（PTM）。由L-乳酸诱导，乳酸化与缺氧和Warburg效应相关，参与一系列生理和病理过程，包括发育、癌症和心血管疾病。有报道称，Snail1的乳酸化可促进心脏内皮-间质转化（EndoMT）并加重MI后心脏纤维化。相反，另一项研究揭示，乳酸和乳酸化在MI后心脏修复中发挥有益作用，因为单核细胞中组蛋白H3 K18乳酸化（H3K18la）促进心脏修复基因（如Lrg1、Vegf-a和IL-10）的表达。因此，乳酸化与MI之间的关系尚未完全阐明。了解心脏损伤前后蛋白质乳酸化的状态可能对MI治疗具有巨大潜力。

为了探索Kla在健康和受损心脏中的生物学重要性，本研究采用稳健的无标记定量方法进行了全局乳酸化组和蛋白质组分析。这种对Kla的全面表征可能为MI和其他心血管疾病的研究开辟新途径。

2 材料与方法

2.1 动物

所有动物实验均根据美国国立卫生研究院《实验室动物护理和使用指南》以及ARRIVE指南2.0进行。C57BL/6J小鼠购自大坪医院实验动物中心。实验方案经第三军医大学动物使用与护理委员会批准（AMUWEC20247120）。

2.2 MI模型构建

通过永久结扎近端左前降支（LAD）冠状动脉，在8周龄雄性小鼠中诱导MI，方法如前所述。简而言之，小鼠通过吸入2%异氟烷（在100%氧气流中输送）维持麻醉，然后在第三和第四肋间作切口。暴露心脏后，用7-0丝线结扎LAD，位置在左心耳远端2–3 mm处。用6-0丝线关闭胸腔，然后拔管。假手术小鼠除不结扎LAD外，经历与MI组相同的手术过程，作为对照组。MI诱导3天后，收集心脏进行分析。

2.3 蛋白质提取和胰蛋白酶消化

心脏组织样本从?80°C取出，放入预冷于液氮的研钵中。加入液氮，将样品精细研磨成粉末。每组样品与四倍体积的裂解缓冲液混合，然后进行超声处理以裂解细胞。在4°C下以12,000 g离心10分钟后，将上清液转移至新的离心管中，并通过增强型BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白质浓度。从每组取等量蛋白质，缓慢加入三氯乙酸至终浓度为20%，然后涡旋混合。在4°C沉淀2小时后，样品在4,500 g下离心5分钟。沉淀用丙酮洗涤三次并风干。然后加入200 mM四乙基溴化铵，并进行超声处理。加入胰蛋白酶[0.1 μg/μl；胰蛋白酶:蛋白质 = 1:50 (m/m)]进行 overnight 消化。然后加入二硫苏糖醇至终浓度为5 mM，并在56°C下还原30分钟。随后，加入碘乙酰胺至终浓度为11 mM，样品在室温下避光孵育15分钟。

2.4 乳酸化肽段富集

将肽段溶解在免疫沉淀（IP）缓冲液中，并将上清液转移至预洗的树脂中。混合物在4°C的旋转摇床上轻轻摇晃 overnight 孵育。孵育后，用IP缓冲液洗涤树脂四次，用去离子水洗涤两次。最后，用0.1%三氟乙酸洗脱缓冲液洗脱与树脂结合的肽段。对于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，所得肽段根据制造商说明使用C18 ZipTips脱盐。

2.5 LC-MS/MS分析

将肽段溶解在液相色谱的流动相A中，然后使用NanoElute超高效液相色谱（UHPLC）系统进行分离。流动相由溶剂A（0.1%甲酸，2%乙腈水溶液）和溶剂B（0.1%甲酸乙腈溶液）组成。液相色谱梯度设置如下：0–18 min，6%–22% B；18–22 min，22%–30% B；22–26 min，30%–80% B；26–30 min，80% B，流速保持在500 nl/min。经UHPLC系统分离后，肽段进入毛细管电喷雾源进行电离，然后通过timsTOF Pro质谱仪进行数据采集。电喷雾源电压设置为1.6 kV，肽段前体及其次级碎片均使用飞行时间（TOF）进行检测和分析。数据采集模式使用数据非依赖性平行累积串行碎裂（dia-PASEF）。一级质谱扫描范围设置为100–1,700 m/z。获取一个一级质谱后，进行8次PASEF模式采集。二级质谱扫描范围设置为425–1,025 m/z，每次扫描窗口为25 m/z。

2.6 数据库搜索

原始质谱数据通过Spectronaut（v17）在Swissprot蛋白质序列数据库中进行搜索。胰蛋白酶/P消化允许最多四个漏切位点。半胱氨酸烷基化被视为固定修饰。可变修饰为甲硫氨酸氧化、N末端乙酰化和赖氨酸乳酸化。为了进一步数据过滤，设定鉴定结果过滤标准：前体和蛋白质错误发现率（FDR）设置为1%；鉴定出的蛋白质必须包含至少一个独特肽段。

2.7 蛋白质组学的生物信息学分析

使用DAVID进行GO富集分析和KEGG通路分析。使用GSEA v4.3.3软件进行GSEA分析。通过MoMo分析工具基于motif-x算法分析修饰位点的 motif 特征。通过与STRING蛋白质相互作用网络数据库比较获得蛋白质相互作用关系，然后使用Cytoscape v3.7.2工具可视化。使用WolF PSORT软件注释蛋白质的亚细胞定位。

2.8 乳酸测量

使用乳酸测定试剂盒按照制造商说明定量心脏组织乳酸水平。简而言之，将组织在四倍体积的乳酸测定缓冲液中匀浆，并离心获得可溶性上清液进行分析。测定程序如下：将样品、酶工作液和显色剂依次加入反应混合物中。涡旋混合后，反应在37°C孵育10分钟，然后加入终止溶液终止。使用光程为1 cm的比色杯在530 nm处测量吸光度。

2.9 免疫荧光染色

石蜡切片脱蜡后，放入柠檬酸钠抗原修复缓冲液中高温抗原修复30分钟。切片在室温下用封闭液封闭60分钟，然后与pan-Kla和心肌肌钙蛋白T（cTNT）抗体在4°C overnight 处理。然后用PBS洗涤切片三次，并在37°C黑暗条件下与Alexa Fluor 488和555二抗孵育60分钟。

2.10 Western blotting（WB）和免疫沉淀（IP）

小鼠心脏组织在裂解缓冲液中匀浆。对于WB，蛋白质样品通过SDS-PAGE分离并转移至硝酸纤维素膜。在5%脱脂牛奶中孵育1小时后，膜在4°C与特异性一抗 overnight 孵育，第二天在室温下与适当的二抗孵育1小时。对于IP，心脏在上述裂解缓冲液中匀浆。裂解物在4°C下以12,000 g离心15分钟。收集上清液，并用BCA蛋白质测定试剂盒测定提取的蛋白质。将预洗的50ug Protein A/G磁珠与5 μg anti-Pan Kla抗体在室温下混合1小时。然后，将1 mg蛋白质裂解物与抗体结合的珠子复合物在4°C orbital shaker上 overnight 孵育。第二天收集上清液，与蛋白质结合的磁珠用PBST（含0.1% Tween-20的PBS）洗涤三次。然后分离磁珠，向磁珠中加入50 μl 1× SDS-PAGE上样缓冲液，并在95°C加热5分钟。对于IP阴性对照，仅使用每个样品的1/40。最后，使用免疫印迹法检测蛋白质。

2.11 统计分析

使用GraphPad Prism（版本9.5.1）或R（版本4.3.3）进行统计分析。蛋白质组学数据的定量程序参考先前的研究。简而言之，对所有样品中的蛋白质/肽段强度进行归一化以生成归一化强度值。随后，对这些归一化强度应用中心化变换以获得相对定量值。将每个修饰位点的相对定量值除以其相应蛋白质的相对定量值，以消除蛋白质表达对观察到的修饰水平的影响。然后，两个比较组之间的倍数变化（FC）定义为每种蛋白质或肽段的平均定量值的比率。在统计分析之前，所有相对定量值都进行log2转换以确保数据近似正态分布。然后使用Shapiro–Wilk检验评估数据分布的正态性，并使用Levene检验评估方差的同质性。对于满足正态性和等方差假设的比较，应用Student's t检验；否则，使用Welch's t检验。此外，对于蛋白质组学数据，通过Benjamini-Hochberg程序对p值进行FDR校正，并计算和呈现所得的q值。本研究中的所有定量图均以平均值±标准差呈现。P值<0.05被认为具有统计学意义。

3 结果

3.1 蛋白质组学分析揭示MI后心脏的代谢重编程

为了阐明小鼠心脏MI的病理生理过程，我们进行了全面的蛋白质组学分析，以比较假手术对照组和梗死心脏之间的全局蛋白质表达模式。我们总共鉴定了28,543个肽段和4,366个蛋白质，其中4,330个蛋白质具有可比性。通过设定FC > 1.5或FC < 1/1.5，且p值 < 0.05，MI后3天有490个蛋白质上调和182个蛋白质下调。然后我们对所有差异表达蛋白质进行了GO富集分析和KEGG通路分析。GO富集分析的结果表明，MI后心脏的一些生物过程受到影响，例如免疫系统过程、各种代谢过程、RNA加工、血管生成和急性期反应。KEGG通路分析显示，最显著的变化与MI后心脏的代谢通路相关。随后，我们通过GSEA询问了代谢通路的状态，发现脂肪酸代谢和氧化磷酸化显著抑制，而缺氧相关通路和糖酵解则倾向于被激活。总之，这些结果将代谢重塑定义为MI后心脏的核心病理生理特征，表现为脂肪酸代谢和氧化磷酸化的协调下调，同时伴随糖酵解的诱导。

3.2 MI后心脏整体Kla水平升高

先前的研究表明，MI可增加循环乳酸水平。随着梗死心脏中糖酵解的增加，我们直接测量了心脏组织的总蛋白质乳酸化状态以及乳酸水平。我们观察到，MI后一天，梗死心脏中赖氨酸乳酸化和乳酸的丰度均略有增加，在MI后三天达到峰值，然后下降。心脏组织的免疫荧光染色也证实了MI后三天蛋白质乳酸化修饰的整体增加。因此，在后续研究中，我们在对照组和MI组中鉴定了Kla位点，旨在探索这种修饰在生理条件和疾病状态下的模式。

3.3 健康小鼠心脏中Kla的鉴定

说明了我们的Kla组学分析的工作流程。对八周龄小鼠进行对照或MI处理。从左心室组织收获蛋白质，并通过靶向乳酸化赖氨酸的IP纯化Kla蛋白质，并通过LC-MS/MS检测。基于蛋白质组学和Kla组学分析，通过将Kla肽段丰度与蛋白质丰度归一化来检测每个位点的Kla水平。为验证MS数据的质量而进行的主成分分析（PCA）显示，对照组和MI组两个组别被分离到两个 distant 象限中。

尽管MI后乳酸水平增加，但健康心脏也会产生乳酸，并且乳酸化在正常条件下发生，正如我们之前的实验所证实。生理条件下心脏蛋白质的乳酸化及其潜在调节功能尚未被描述。因此，我们首先尝试鉴定健康心脏中的所有Kla位点。从小鼠心脏的477个蛋白质中总共鉴定出1,674个Kla位点。为了研究Kla motif，我们比较了Kla位点周围的氨基酸与小鼠蛋白质组，发现在许多位置（-10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, +6, +7, +8, +9和+10）带正电荷的赖氨酸（K）过表达，并且在许多位置（-10, -9, -8, -7, -6, -5, -4, -3, -2, -1, +1, +2, +3和+4）非极性丙氨酸（A）显著过表达，而带负电荷的谷氨酸（E）和非极性甘氨酸（G）分别在+3位置或-2, -1, 1, +1, +2, +3和+5位置 largely 过表达。近一半的蛋白质（44.03%）只有一个Kla位点，一小部分蛋白质（1.26%）有超过20个Kla位点。肌球蛋白-6和肌联蛋白这两个重要的细胞骨架蛋白质分别有83和77个Kla位点，远多于其他鉴定出的蛋白质。我们使用预测工具（Wolf PSORT）对从小鼠心脏组织鉴定出的所有赖氨酸乳酸化蛋白质进行了细胞区室分析，发现这些蛋白质广泛分布于细胞核、线粒体、细胞质、质膜和细胞外空间，表明乳酸化修饰可能调节不限于特定细胞亚位置的生物学功能，但可能涉及各种细胞区室。因此，为了理解赖氨酸乳酸化底物的生物学功能，我们使用GO注释数据库进行了富集分析。我们的数据显示，赖氨酸乳酸化蛋白质显著富集于细胞代谢过程， specifically 富集于质子动力驱动的线粒体ATP合成、脂肪酸代谢过程、有氧呼吸和三羧酸（TCA）循环。PFAM结构域数据库的分析表明，赖氨酸乳酸化蛋白质富集了酰基-CoA脱氢酶、PDZ结构域包含蛋白质和需要生物素的酶。为了理解涉及赖氨酸乳酸化的细胞通路，我们进行了KEGG通路的富集分析。赖氨酸乳酸化蛋白质主要与代谢通路、糖尿病性心肌病、碳代谢和氧化磷酸化相关。我们使用STRING v12.0数据库构建并可视化了赖氨酸乳酸化蛋白质的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络。我们的数据集揭示了一个广泛的、高度互连的网络，具有形成独特蛋白质复合物模式的节点簇。使用MCODE工具，我们在赖氨酸乳酸化蛋白质中鉴定出许多高度连接的子网络，包括有氧呼吸、翻译、糖酵解、脂肪酸β-氧化和肌节组织、TCA循环和mRNA加工。

3.4 MI后改变的Kla的鉴定

我们接下来比较了对照组和MI组之间Kla水平的变化。与对照组相比，平均Kla水平高于1.5或低于0.67，且P值 < 0.05，被视为显著变化。总共有53个蛋白质的61个位点表现出Kla水平的显著增加，27个蛋白质的30个位点表现出Kla水平的显著降低。维恩图显示，在53个表现出Kla位点增加的蛋白质中，有79%的蛋白质含量没有变化，在27个表现出Kla位点减少的蛋白质中，有74%的蛋白质含量没有变化。以上结果表明，Kla修饰可能在MI后独立于蛋白质水平变化而起作用。为了识别这些经历Kla修饰改变的蛋白质所涉及的病理生理过程，我们进行了GO和KEGG分析。如图所示，表现出Kla变化的蛋白质主要与琥珀酸代谢过程、TCA循环、mRNA加工、心脏收缩力的调节、线粒体ATP合成偶联蛋白质转运和RNA剪接相关。这些蛋白质涉及的细胞成分包括线粒体、细胞质、核糖核蛋白复合体和Z盘。一致地，KEGG分析也显示，表现出Kla变化的蛋白质主要与碳代谢、TCA循环和心肌收缩相关。总之，乳酸化可能影响小鼠心脏MI后的能量代谢、RNA合成和细胞骨架。

进行细胞区室分析以探测包含差异乳酸化赖氨酸残基的蛋白质的亚细胞定位。根据Wolf PSORT的预测，发现上调的乳酸化蛋白质在缺血心脏的细胞核中更有代表性，暗示乳酸和Kla修饰的分布提示健康或缺血心脏可能具有不同的亚细胞定位倾向。然后我们进行了PPI分析，并观察到大多数乳酸化蛋白质之间存在复杂的相互作用，表明Kla修饰通过影响一组具有特定功能的蛋白质发挥广泛的调节作用。

3.5 MI后各种代谢酶的Kla水平广泛改变

许多代谢酶在MI后表现出广泛的Kla变化，并且主要与TCA循环、脂肪酸代谢、葡萄糖代谢和呼吸电子相关。两个热图分别显示了这些代谢酶的所有改变了的Kla位点及其在对照组和MI组之间的蛋白质水平。如前所述，Kla变化和蛋白质水平变化可能不一致地改变。例如，CS、SUCLG1、SUCLG2、SDHA和SDHB这五个参与TCA循环的重要酶分别显示出上调的Kla位点，而它们的蛋白质水平在MI后下降。为了更好地可视化代谢酶的 changed Kla 位点以及受影响的代谢过程，我们根据蛋白质组和乳酸化组绘制了一个显示代谢通路概览的总结图。使用IP和WB验证了代表参与TCA循环和葡萄糖代谢的蛋白质CS和PFKL的Kla变化。

3.6 MI后细胞骨架蛋白的Kla水平广泛改变

细胞骨架蛋白，包括肌丝、微管和中间丝，对于维持细胞形状和结构完整性、调节节律性心肌收缩力、驱动细胞分裂和参与细胞信号转导至关重要。MI后，细胞骨架蛋白表现出广泛的 altered Kla，特别是肌丝蛋白。我们还绘制了两个热图，分别显示这些细胞骨架蛋白的所有改变了的Kla位点以及对照组和MI组之间的蛋白质水平变化。在粗丝蛋白质中，MYH6表现出最多的 altered Kla 位点，也许因为它是心肌细胞的主要结构蛋白。此外，七种微管蛋白，包括TPPP、TPPP3、RCC2、TBCB、MAPRE1、ARL3和RAN，表现出Kla修饰的一致增加。基于蛋白质组和乳酸化组的细胞骨架蛋白Kla水平变化的概览如图所示。使用IP和WB验证了选定子集（MYH6、CSRP1和PDLIM1）的Kla。

3.7 MI后各种RNA结合蛋白的Kla水平广泛改变

基于Kla组学分析，我们注意到一系列参与RNA代谢的蛋白质表现出Kla水平的显著变化。RNA代谢包含RNA分子生命周期中的任何事件，包括合成、加工、运输、翻译和降解。我们的结果表明，表现出广泛Kla改变的蛋白质与RNA翻译、剪接、3'末端加工、核质运输和翻译相关。值得注意的是，所有在细胞核中发生的事件（包括转录、剪接和3'末端加工）中起作用的蛋白质，其Kla水平均显示增加。我们之前的细胞区室分析结果表明，增加的乳酸化蛋白质在缺血心脏的细胞核中更有代表性。上述事实表明，梗死心脏的乳酸化修饰更常发生在细胞核中。我们选择DDX5和SARNP作为代表蛋白质，使用IP和WB验证它们的Kla变化。

4 讨论

乳酸化是最近发现的一种PTM，与细胞代谢密切相关。MI发生后，局部缺血和缺氧导致糖酵解增加，导致乳酸积累。在P300、GCN5和HBO1等酶的催化下，乳酸基团可以直接附着在蛋白质的赖氨酸残基上，从而改变组蛋白和非组蛋白的功能。我们的研究直接显示，MI后蛋白质乳酸化的整体水平增加，但这种增加随着时间的推移而下降，表明心脏逐渐适应缺血和缺氧条件。在不同的心脏病状态下，整体乳酸化表现出动态变化，某些关键蛋白质的乳酸化通过调节蛋白质功能影响疾病进展。例如，She等人（2024）报道了缺血再灌注（I/R）损伤后心肌细胞中整体乳酸化水平上调，其中线粒体蛋白MDH2的乳酸化诱导铁死亡，导致线粒体功能障碍。Zhang等人（2023）发现心力衰竭中蛋白质乳酸化水平下调，特别是α-MHC K1897的乳酸化，影响α-MHC和肌联蛋白的结合，加剧Ang II诱导的小鼠心功能不全。然而，据我们所知，尚未有关于生理条件下心脏乳酸化修饰特征的系统报道，也没有对MI后心脏全局蛋白质乳酸化变化的分析。因此，我们设计了相关的乳酸化组分析，并提供了全面且具有指导意义的心脏蛋白质乳酸化修饰图谱。

首先，我们描述了未受伤心脏中乳酸化的特征。She等人的组学数据（2024）在小鼠心脏中鉴定了238个蛋白质的1,026个Kla位点，而Zhang等人的数据（2023）鉴定了159个蛋白质的576个Kla位点。在我们的组学数据中，我们总共鉴定了477个蛋白质的1,674个Kla位点，这比先前报道的数量更大，可能是由于检测技术的改进。在所有经历乳酸化修饰的蛋白质中，近75%的蛋白质只有1-3个Kla位点，而两个蛋白质有超过20个Kla位点。这两个蛋白质是肌球蛋白-6和肌联蛋白，是心肌细胞中主要的细胞骨架蛋白。一个可能的原因是这两个蛋白质不仅在心