肿瘤微环境空间关系解析新策略：揭示细胞表型与患者特征的关联

本综述系统介绍了一种创新的空间系统分析流程，通过整合多重免疫荧光（mIF）成像与可解释性监督机器学习模型（如OPLS），量化肿瘤微环境（TME）中细胞的空间共定位模式，揭示了其与细胞状态（如IFNγ+淋巴细胞活化）和临床特征（如肿瘤分级、组织学亚型）的深层关联，为精准免疫治疗提供新见解。

　　

引言

肿瘤微环境（TME）是一个由恶性细胞、免疫细胞、基质细胞、细胞外基质、血管淋巴管及信号分子组成的复杂细胞景观，其空间组织模式深刻影响肿瘤进展、治疗反应和患者预后。近年来，多重成像和转录组测序技术的进步揭示了TME在组成和空间排列上的高度异质性，但仍需开发有效整合和解释这些复杂高维空间数据的方法学。直接肿瘤-免疫相互作用依赖于免疫细胞与肿瘤细胞及彼此之间的空间邻近性。免疫细胞在TME中扮演多样且有时相反的角色，取决于其类型、活化状态和上下文。某些免疫细胞如细胞毒性T细胞和自然杀伤（NK）细胞可直接攻击杀伤恶性细胞；而其他细胞如调节性T细胞和某些巨噬细胞亚群则可能通过抑制抗肿瘤免疫或促进组织重塑来支持肿瘤生长。除与肿瘤细胞相互作用外，免疫细胞之间也相互接触以协调免疫应答。这些免疫-免疫相互作用可激活效应功能、塑造分化途径并影响局部细胞因子环境。TME中细胞间的相互作用通过细胞表面受体相互作用和分泌的信号分子进行，分别需要相互作用的细胞在近分泌和旁分泌信号的相关距离内接近。观察典型细胞直径（5-20 μm）半径内的细胞邻居可能揭示细胞表面受体相互作用的潜力，而将分析扩展到200-250 μm则揭示了旁分泌信号限制内的细胞。

多重成像技术的进步，如多重离子束成像（MIBI）、索引共检测（CODEX）、成像质谱流式（IMC）以及多重免疫荧光（mIF）成像或多重免疫组织化学（mIHC），使得能够在保存空间结构的同时对肿瘤区域内细胞进行同步蛋白表型分析。本研究使用mIF探索空间共定位，但该系统框架可应用于其他空间蛋白质组和转录组技术获得的数据。

尽管空间分析在阐明抗肿瘤免疫机制、预测治疗反应和评估预后方面已被证明有效，但现代空间数据的高维性带来了新的分析挑战。随着空间分析技术的改进和日益复杂数据的产生，多变量方法已成为解释TME空间异质性的重要工具。许多此类方法利用机器学习来解析复杂数据并创建临床相关预测。虽然深度学习在这些任务中日益流行，但其黑箱性质常常限制生物可解释性。相比之下，监督统计学习方法（如偏最小二乘判别分析，PLS）提供了透明、可解释的模型，对于假设生成和机制洞察仍有价值。然而，机器学习在空间多组学中的应用仍然不足，部分原因是分析框架未能跟上空间技术的快速发展。因此，如何最好地构建空间数据进行分析、哪些空间特征最具生物意义或预测性、以及可以使用这些工具严谨解决何种类型的问题仍不清楚。

为填补这一空白，本研究设计了一个系统分析框架，用于识别和表征从单细胞到患者特征多个尺度的邻域共定位谱。该方法响应了对可解释、多变量模型的需求，这些模型能够将空间复杂性整合到可检验的生物和临床假设中。该框架通过纳入严格的统计流程和强调生物可解释性，建立在现有的邻域量化方法之上。通过利用单细胞分辨的邻域谱和多变量分析，增强了从微米尺度到患者特征准确分类细胞和肿瘤状态的能力。

方法

组织样本与数据摘要

本研究包括一个36名非小细胞肺癌（NSCLC）患者的队列，其切除组织如前所述进行了分析。使用PerkinElmer Vectra 3.0成像系统对这些组织样本进行多光谱荧光成像。首先执行质量控制措施，包括检查荧光强度分布和验证标记阳性阈值、排除细胞计数低的感兴趣区域（ROI），并确认所有ROI和细胞被唯一识别。此外，由于缺失元数据或恶性细胞上异常的CD56表达（这混淆了我们使用CD56作为NK细胞标记的用途），四名患者被排除在下游分析之外。这产生了一个最终由32名NSCLC患者组成的队列用于分析和表征。

mIF成像与地理空间分析

NSCLC患者组织如前所述进行分析。简言之，它们用针对pan-细胞角蛋白（PanCK）、HC10单克隆抗体（一种pan-主要组织相容性复合物I类（MHC I）抗体，染色MHC I等位基因HLA-A、-B和-C）、CD3、CD8、CD56、干扰素γ（IFNγ）和DAPI的抗体进行染色。使用HALO（Indica Labs的病理学定量图像分析）分割单个细胞并分配染色阳性。组合标记表达用于分类细胞表型，并训练分类器基于PanCK阳性识别肿瘤和基质区域。然后为下游分析分配每个细胞的特定表型和区域注释。

细胞邻域评分

细胞邻域向量量化

使用内部自定义算法构建邻域谱。简言之，使用从HALO获得的单个分割细胞的二维坐标在Python中确定NSCLC肿瘤中的细胞间空间共定位。计算每个细胞与载玻片上每个其他细胞之间的欧几里得距离；将中心到中心欧几里得距离小于用户指定半径r的中心细胞的细胞定义为r-邻居。对每种表型的r-邻居进行计数，以产生每个单个细胞的邻域谱。我们将特定表型（例如，肿瘤细胞周围的CD8邻居）的邻居个体计数称为邻域分数。跨所有表型的完整分数集形成该细胞的邻域向量，以结构化的可解释格式表示其空间背景。

细胞间K函数分析

Ripley的K函数是一种空间统计工具，用于评估点（此处为细胞及其表型亚集）的空间分布是否偏离完全空间随机性。它评估细胞是倾向于聚集、排斥还是独立分布，这可以深入了解潜在的协调机制。交叉K函数将这种分析扩展到两个不同的表型亚集，以成对方式量化它们的空间共定位或分离程度。此处使用R版本4.2.1中的Spatstat包进一步分析NSCLC肿瘤中的空间共定位模式，以产生交叉K函数轨迹，在高达200μm的连续半径范围内描述感兴趣细胞类型对的共定位模式，并与作为零模型的完全随机放置细胞（均匀泊松）过程进行比较。这种连续范围分析补充了先前描述的邻域向量计算。

质量控制与预处理

首先使用HALO知情的转换比率将距离从像素转换为微米。通过绘制细胞染色强度直方图以及阳性 cutoff 来验证染色阳性阈值，并在组织样本间保持一致。表型标签由生物信息知的蛋白质标记组合定义。标记和表型枚举后，通过百分比组成总结3 mm²感兴趣区域（ROI）内的细胞密度。通过移除超过90%细胞未标记的ROI以及细胞少于500个的ROI进行质量控制。此外，三名患者的肿瘤对PanCK和CD56（我们的NK细胞标记）染色阳性。这些患者也被移除。经过此质量控制和过滤后，剩下414个ROI，由属于33名患者的5307540个细胞组成。其中一名患者缺乏组织学元数据，被包括在细胞水平分析中，但在患者水平分析中被移除。对于分级分析，患者被进一步过滤为仅那些具有腺癌组织学分类的患者。

归一化

计算感兴趣细胞的邻域分数后，使用log(1 + p)缩放对所得邻域分数进行对数转换，以减少极端值的影响。然后对这些邻域分数跨每个表型邻域标签进行z评分。归一化的邻域分数矩阵随后用作构建偏最小二乘判别分析（PLSDA）模型的输入。

在比较不同肿瘤或ROI之间的细胞的情况下，这些细胞通常具有不同的总体免疫细胞密度，细胞关系可能被每种细胞类型的密度夸大，这可能不代表相互作用的差异和“有意”的细胞共定位。如果正在评估相互作用的富集，则可能需要进行归一化。因此，对于诸如应用4中的肿瘤或ROI水平分析，执行了额外的归一化水平。这些邻域向量首先如前所述计算，然后通过除以每个ROI中某种表型标签（p_i）的中心细胞总数（N_c）以及该ROI中某种表型标签（p_j）的邻居数量的平方根（√N_n）进一步归一化。除以N_c计算每个ROI或患者的平均值。除以√N_n解释了细胞类型特定的密度偏差。对每个表型对重复此过程，产生每个中心和邻居细胞组合的归一化邻域分数。然后对按ROI归一化的邻域分数矩阵进行z评分，并用作PLSDA模型的输入。

多变量判别分析与采样技术

偏最小二乘（PLS）是一种强大的监督线性机器学习方法，已广泛用于识别连续结果选择或组间差异的顶级贡献者，分别称为PLS回归（PLS-R）和PLS判别分析（PLS-DA）。正交化PLS（OPLS）通过正交化模型构建于此框架之上，使得Y的变异在单个潜在变量（LV）上捕获，而其他潜在变量描述与Y正交（不贡献）的方差以便于解释。此处，使用pyopls包进行正交化和scikit-learn包中的PLSRegression函数在Python中生成OPLS模型。对于OPLS-DA模型，报告了5折交叉验证（CV）准确性，并通过将构建模型的CV准确性与基于随机打乱标签数据的1000个OPLS-DA模型的5折CV准确性进行比较来计算经验置换检验p值。对于OPLS-R模型，通过将构建模型的均方误差（MSE）和CV Q²与基于随机排列连续标签数据的1000个OPLS-R模型进行比较来凭经验计算显著性。变量投影重要性（VIP）分数用于排名预测变量对响应变量的贡献。VIP分数量化每个变量对PLS-DA或PLS-R模型的贡献，总结每个预测变量在解释响应变量方差方面的影响力。VIP分数较高的变量被认为对组分离（PLS-DA）或响应预测（PLSR）更相关，并且VIP分数通常用于指导特征选择。实践中，VIP分数大于1的变量通常被认为对响应变量的贡献高于平均水平。

对于涉及大量预测变量（此处称为特征）的患者水平分析，我们应用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）进行特征选择，然后仅使用LASSO选择的特征进行分类。我们使用来自sklearn的LassoCV函数和10折交叉验证来确定最佳正则化参数（alpha）。然后构建相关网络以识别和可视化与LASSO选择的那些变量高度相关（|r| > 0.75）的其他变量。

还使用F1分数和受试者工作特征曲线下面积（AUROC）值评估模型性能。F1分数提供了包含精确率和召回率的综合度量，从而考虑了类别不平衡。AUROC量化模型在所有分类阈值上区分类别的能力。

下采样和自举用于平衡和稳健建模

当对不平衡数据集执行判别分析时，其中目标变量的分布偏向一个类别（例如，应用2），所得模型可能偏向多数类别。这是细胞水平分析中的常见问题。为解决此问题，我们采用分层下采样与自举相结合，以确保类别的平衡表示并量化模型性能的变异性。

具体而言，对于细胞水平分析，在建模之前对过度代表的中心细胞表型进行下采样，匹配少数组的样本量（默认为较小组的50%）。这种重采样在多个自举迭代中重复（每个样本大约10次迭代），生成模型准确性和VIP分数的分布。这种自举分布使我们能够计算变异性度量（例如，标准差、置信区间），提供更可靠的模型稳健性度量。跨应用中，置换检验p值、精确率和F1分数得到改善，表明对数据的整体拟合更好。

对于回归任务，我们类似地应用自举；在每次迭代中随机抽取固定数量的样本进行替换以拟合OPLS模型。使用5折交叉验证评估模型性能以计算均方误差（MSE）和Q²分数。

为确定最佳自举参数，我们进行了敏感性分析，改变样本大小和迭代次数，同时保持数据集覆盖恒定（10倍）。该分析显示，模型稳定性（定义为性能度量（例如，交叉验证准确性、MSE）的收敛和特征重要性排名（VIP分数）的低方差）取决于数据集大小和异质性。通过此分析，我们选择回归模型的样本大小为3705，自举迭代次数为2001，分类模型为较小组大小的50%，以确保可靠性和可重复的估计。

我们还在区域水平分析和空间统计中应用下采样以解决观察值之间的非独立性。对于患者水平比较，我们将每位患者采样的ROI数量匹配到队列中最小数量的50%，重复子采样以纳入更多数据，同时保持类别平衡。对于细胞密集的表型，对中心细胞进行下采样以减轻当相邻细胞共享微环境特征因此不能被视为独立时出现的统计挑战。因此，每个ROI采样的细胞数量匹配到可以容纳在3mm乘3mm ROI内的近似非重叠邻域的数量。这对应于30μm半径大约500-700个细胞，200μm半径每个ROI大约15-20个中心细胞，以最小化空间重叠并确保观察值之间改进的独立性。

对于组比较，采用Mann-Whitney U检验作为一种非参数方法，在数据不满足正态性假设时提供稳健的替代方案。然而，认识到传统统计方法可能仍受空间依赖性的影响，置换检验也被实现为一种替代方法。在置换检验中，将真实的邻域分数与从随机化细胞标签生成的零分布的邻域分数进行比较。该方法提供了一个灵活的、数据驱动的框架，考虑了潜在的空间结构并降低了假阳性发现的风险。

空间共定位分析建议

我们根据使用空间单细胞分辨多重数据（如多重免疫荧光成像）的经验编制了一个最佳实践表，该表可应用于其他空间蛋白质组学和转录组学数据。对于每个步骤，该表概述了具体建议，提供了背后的理由，并列出了可实施的工具和包。我们希望该资源将作为有效管理和分析类似数据并在此基础上构建的资源。

结果

我们的流程是一个两步过程，以单细胞空间数据作为输入，首先量化每个细胞周围的局部细胞邻域，然后应用多变量统计分析以揭示空间模式和关联。使用先前发布的NSCLC肿瘤mIF数据集构建多变量统计模型，以将量化的细胞-细胞共定位与跨越细胞状态（应用1和2）到组织和患者水平特征（如组织学亚型或肿瘤分级）（应用3和4）的尺度的细胞和临床指标联系起来。我们提供了数据预处理和归一化、定量空间度量和每个细胞周围半径的选择策略，以及严格数据分析实践和拟合优度标准的建议。

细胞分割的多重免疫荧光（mIF）数据支持单细胞分辨率分析，允许为每个细胞分配表型并按载玻片计数。然后可以使用反映潜在接触基和旁分泌相互作用的定义空间影响圈来量化每个细胞在其局部邻域内对其他细胞类型的暴露水平。该框架能够系统量化细胞类型之间的成对空间关系，为下游空间统计和机器学习分析奠定基础。

为评估这种空间背景的附加价值，我们首先询问邻域共定位度量是否提供了超越传统细胞计数数据（即，每个载玻片上给定表型的细胞数量（此后称为“计数”）的见解。为此，我们训练了一个OPLS模型来对感兴趣区域（ROI）进行分类，基于肿瘤区域中表达MHC I类的PanCK⁺细胞的百分比是高于还是低于20%。选择该阈值作为一个生物相关的整数，接近分布的中部（中位数= 13%，平均值= 25%）以促进可解释性。然后我们比较了仅在计数上训练的模型、仅在邻域特征上训练的模型或两者组合的CV分类性能。该分析显示，仅使用邻域特征训练的模型优于仅使用计数的模型。包含两者产生了相似、略微改进的准确性，其中合并了计数和邻域特征 amongst VIPs。此外，来自组合模型的变量投影重要性（VIP）分数证明基于计数和邻域衍生的特征都有意义地贡献于分类，邻域分数在列表中排名更高，强调了空间背景的附加价值。

来自点模式转换的邻域共定位数据呈现偏向零的分段分布，反映了缺乏给定表型邻居的细胞的丰度——无论是常见的还是罕见的。为评估分布特性，专注于非零值，我们将其经验累积分布函数（CDF）与正态分布的CDF进行比较。Kolmogorov–Smirnov（KS）检验证实对数转换改善了跨所有表型数据的非零部分的正态性。

为评估转换对模型性能的影响，我们训练了一个OPLS模型来基于邻域共定位特征分类测试细胞表型——即IFNγ⁺ T细胞。然后我们比较了在原始数据与对数转换数据上训练的模型，显示后者的准确性得到改善。残差分析——一种预测误差的统计度量——进一步支持了这种改进。虽然原始数据产生双峰残差分布，但对数转换数据产生单峰、居中的残差，表明更一致和无偏的模型预测。这些发现支持将对数转换应用于邻域数据，用于假设近似正态性的下游多变量分析。

这些对数转换的邻域谱作为下游多变量建模的输入，以揭示与细胞或组织水平表型相关的空间模式。尽管该框架与各种建模方法兼容，但我们选择OPLS方法以平衡预测性能和可解释性。在基准测试实验中，OPLS-DA优于逻辑回归，并实现了与随机森林分类器相当的准确性，后者可能更好地捕获非线性关系。鉴于性能差异小和可解释性的优势，我们在后续应用中选择OPLS-DA。

应用1：淋巴细胞聚集预测其焦点的IFNγ表达

我们将此框架应用于探究几个生物学问题。在第一个应用中，我们专注于细胞的表型或功能状态与其局部邻域谱之间的关系，即其附近各种表型细胞的数量。细胞毒性和免疫协调首先需要免疫细胞的激活。这种激活的一个标记是产生IFNγ，一种主要由淋巴细胞产生的炎症细胞因子。T细胞和NK细胞的激活及其随后的IFNγ产生部分与其微环境相关。IFNγ表达可由抗原识别或与相邻细胞上的同源受体相互作用触发，进而可促进额外免疫细胞的招募和激活。我们假设图像中细胞的IFNγ强度可用作该细胞IFNγ表达的代理。由于我们观察到淋巴细胞中IFNγ强度的广泛分布，我们假设T细胞和NK细胞中的IFNγ强度与其周围局部邻域的组成相关。为测试此点，我们将分析集中在所有T细胞和NK细胞上，并量化每个单个细胞在30 μm和200 μm范围内的邻居。然后我们构建了一个OPLS回归（OPLSR）模型来基于这些空间特征预测IFNγ染色强度。

IFNγ表达的主要预测因子包括在肿瘤和基质区室中其他IFNγ⁺淋巴细胞的局部存在，在一致于近分泌和旁分泌信号的距离上。在200 μm半径内的关联——其中直接细胞-细胞接触不太可能——具有稍强的关联，表明活化淋巴细胞的共定位可能独立于直接接触发生，这更可能在30 μm内。没有特征与IFNγ强度显著负相关。这种模式在图像中得到视觉确认，其中IFNγ表达细胞形成空间口袋。

这些发现支持一个模型驱动的假设：一个淋巴细胞中的IFNγ表达通过直接信号传导、额外免疫细胞的招募和增强的抗原呈递的组合，促进其他淋巴细胞的激活和IFNγ产生。这可能反映了一个协调的正反馈循环，放大免疫应答，这是IFNγ信号网络的 well-described 特征，而不是直接的细胞间诱导。此类循环受到严格调控以防止过度炎症。

应用2：CD8^- CD3⁺ T细胞中的IFNγ强度与T细胞聚集相关

在第二个应用中，我们调查了CD8^- CD3⁺ T细胞（即CD4 T细胞）的激活状态是否可以通过其邻域谱预测。虽然CD8⁺ T淋巴细胞可以识别和杀伤呈递肿瘤衍生抗原的MHC I类 bearing 肿瘤细胞，但CD4⁺ T细胞在检测到抗原呈递细胞（APC）上MHC II类分子呈递的肿瘤抗原时以细胞因子释放响应，以协调调节抗肿瘤免疫。鉴于其在免疫调节中的关键作用，我们假设活化（IFNγ⁺）CD4⁺ T细胞在TME内表现出与IFNγ^- CD4⁺ T细胞不同的相互作用模式。尽管本研究未使用抗CD4抗体识别CD4 T细胞，我们近似认为大多数CD8^- T细胞确实是CD4⁺ T细胞，因为缺乏CD4和CD8的T细胞占成熟T细胞的不到5%。通过检查延伸30-200 μm的邻域中的共定位模式探索了这些相互作用的空间性质。

为测试此假设，我们量化了所有CD8^- T细胞的邻域谱，并对IFNγ⁺和IFNγ^- CD8^- T细胞的邻域谱进行了单变量比较。然后我们构建了一个以CD8^- T细胞作为中心细胞、IFNγ表达作为二元分类器、邻域谱作为模型特征的OPLS-DA模型。IFNγ⁺和IFNγ^- CD8^- T细胞数量之间的不平衡需要使用随机下采样来解决组大小差异。应用迭代下采样以确保所有数据被利用，同时保持平衡的组表示。该方法提高了模型精确率和整体性能。使用X分数图进行的模型评估证明了稳健的性能，包括高准确性和置换检验中的强大结果。

VIP分数突出了在200 μm信号距离上的IFNγ⁺淋巴细胞，包括CD8⁺ T细胞、CD8^- T细胞和NK细胞（CD56⁺），作为区分活化和非活化CD8^- T细胞邻域的最强贡献者。为解决组大小不平衡，我们应用迭代随机下采样，确保模型中IFNγ± CD8^- T细胞的平等表示。通过1000次置换验证了这种下采样方法的稳定性，一致显示稳定的模型性能。使用标准机器学习度量评估模型性能，包括精确率-召回曲线，证明了模型在区分两组方面的稳健性。

这些结果强化了IFNγ⁺淋巴细胞在塑造TME免疫景观中的重要性。使用Ripley的交叉K函数对VIP分数识别的关键特征进行进一步分析，揭示了活化CD8^- T细胞与其他IFNγ⁺淋巴细胞（包括CD8 T细胞和NK细胞）在一系列半径上的强空间关系。在交叉K函数图中观察到的显著且一致的分离支持了以下假设：IFNγ⁺ CD8^- T细胞具有独特的邻域谱，暗示其在TME内抗肿瘤免疫应答的调节和协调中的积极作用。

使用这些数据并基于现有文献，我们可以假设肿瘤-免疫界面上的机制相互作用。在NSCLC患者中，T细胞和NK细胞的IFNγ介导的串扰可能在免疫应答中起关键作用。CD8^- T细胞是IFNγ的主要生产者，它激活其他免疫细胞，包括抗原呈递细胞。观察到的CD8^- T细胞与其他淋巴细胞之间的空间关系表明，IFNγ分泌，尤其是来自CD8^- T细胞，可能增强淋巴细胞聚集，从而导致细胞因子和趋化因子分泌增强、额外免疫细胞招募和激活，这些共同促进TME中强大的局部免疫应答。虽然当前研究未直接评估IFNγ产生或功能结果，但这些发现产生了可检验的假设，应在未来工作中使用空间转录组分析或功能T细胞测定来验证细胞因子信号传导和通路激活原位。

应用3：肿瘤组织学亚型塑造MHC I类空间关系

肿瘤组织学是NSCLC免疫景观的关键决定因素，不仅影响浸润水平，还影响恶性细胞周围的空间组织。尽管肺腺癌（LUAD）和鳞状细胞癌（LUSC）都被分类为NSCLC，但它们在形态学、突变负荷、免疫原性和临床结果上显著不同，所有这些都以不同的方式塑造肿瘤微环境。此处我们调查了这些亚型特异性特征是否扩展到MHC I类表达肿瘤细胞的空间邻域。

为MHC I⁺ PanCK⁺癌细胞生成邻域谱，这些细胞居住在30-200 μm信号距离内。单变量分析揭示了LUAD和LUSC亚型之间肿瘤和免疫细胞邻居组成的显著差异。为量化这些差异，我们开发了一个OPLS-DA模型来基于每个癌细胞的邻域谱预测组织学分类，LUAD或LUSC。该模型实现了83%的交叉验证准确性，优于使用打乱标签生成的1000个模型。VIP分数强调了与T淋巴细胞的增强共定位作为LUSC居住的MHC I⁺ PanCK⁺细胞的区分特征，而LUAD居住的细胞表现出与其他MHC I⁺ PanCK⁺肿瘤细胞的更大共定位。由于样本大小不平衡偏向LUAD，应用随机下采样在1000次置换中平衡组大小，一致显示稳定的模型性能。精确率-召回曲线证明了跨度量的 consistent 模型性能，确认了分析的稳健性。

为进一步验证这些发现，我们使用交叉K函数分析评估MHC I⁺ PanCK⁺细胞与关键免疫群体（IFNγ^- CD8 T细胞、CD8^- T细胞和NK细胞）在一系列连续半径上的空间关系，这揭示了围绕LUSC居住的MHC I⁺肿瘤细胞的显著共定位，证实了OPLS-DA发现并在感兴趣半径上验证了它们。LUSC增加的突变负荷和肿瘤相关抗原表达可能 underlie 其更大的免疫原性。然而，增加的免疫耐受或抑制可能限制活化免疫细胞的作用，导致更差的预后。调节性CD4 T细胞（Tregs），存在于CD8^-CD3⁺群体中，也可能调节LUSC肿瘤中的局部免疫应答。相反，LUAD的复杂形态可能限制免疫细胞浸润，但可能 foster 更强大的T细胞激活，增强MHC I⁺癌细胞微环境内的免疫细胞相互作用。

总之，这些发现证明组织学亚型不仅与肿瘤的分子特征相关，而且与肿瘤微环境内免疫细胞的空间组织相关。这些模式表明肿瘤亚型可能影响或反映免疫背景，激励进一步研究肿瘤内在特征与空间免疫架构之间的联系。此类见解最终可能为开发更量身定制的治疗方法提供信息，尽管需要额外和功能验证来支持亚型特异性策略。

应用4：高级别LUAD肿瘤富含CD8⁺ T细胞浸润和MHC I类表达

TME中的细胞间相互作用被认为影响免疫调节，从而影响患者结果。为调查这种联系，我们接下来询问肿瘤中的细胞共定位模式是否与临床特征相关，特别是肿瘤分级。为此，我们比较了分类为高级别和低级别肿瘤之间的成对共定位模式。癌症的分级反映了恶性细胞与健康细胞相比在