黄连通过抑制IL-17RA/NF-κB信号通路改善2型糖尿病相关代谢功能障碍性脂肪性肝炎

本研究揭示中药黄连（Coptidis rhizoma）及其活性成分表小檗碱（EPI）通过抑制IL-17RA/NF-κB信号通路，显著改善2型糖尿病（T2DM）相关代谢功能障碍性脂肪性肝炎（MASH）小鼠的肝脏炎症、代谢紊乱和胰岛素抵抗（IR），为开发基于天然产物的多靶点治疗策略提供了重要理论依据。

　　

引言

营养失衡导致的饮食行为紊乱是2型糖尿病（T2DM）及其相关代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的主要诱因。在MASLD疾病谱中，代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）是一个关键转折点，与进行性肝损伤风险增加相关，包括肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）。T2DM和MASH共存会协同加剧疾病进展和不良临床结局，成为代谢性和肝病管理的主要挑战。

尽管具有临床重要性，针对T2DM相关MASH的有效药物治疗仍然有限。当前治疗策略主要依赖长期生活方式管理和对症治疗，因为T2DM相关MASH的发病机制复杂且涉及多因素，包括代谢失调、慢性炎症和进行性纤维化。尽管resmetirom作为首个FDA批准的用于MASH伴肝纤维化的治疗药物在临床试验中显示出潜力，但其在真实世界T2DM相关MASH中的疗效可能与随机对照试验（RCT）结果存在差异，这突出表明迫切需要更有效和靶向的治疗策略。

T2DM相关MASH的发病机制涉及代谢功能障碍和免疫失调之间复杂的相互作用，导致促炎和促纤维化的肝脏微环境。在T2DM相关MASH的关键免疫病理特征中，辅助性T淋巴细胞17（Th17）在肝脏中的激活和浸润，以及强效促炎因子白细胞介素17A（IL-17A）的过量产生，是最具特征的组织病理学变化，在驱动肝脏炎症、胰岛素抵抗（IR）和纤维化中起关键作用。这些过程被认为是T2DM相关MASH发生和发展的核心，使得白细胞介素17受体A（IL-17RA）信号通路成为一个有前景的治疗靶点。

传统中药（TCM）长期以来被用于管理代谢紊乱，并因其多成分、多靶点的治疗潜力和相对良好的安全性而受到越来越多的关注。黄连是一种知名植物药，收载于《中华人民共和国药典》，在中医理论中以其“清热燥湿、泻火解毒”的特性而广泛使用，常用于糖尿病及相关并发症的治疗。现代药理学研究表明，黄连通过增强葡萄糖消耗和抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性发挥降血糖作用。在我们之前的临床研究中，黄连作为中药复方“消脂化纤汤”的关键成分，显著改善了MASH患者的肝功能，降低了IR和血清甘油三酯（TG）水平，并减轻了肝脏炎症和纤维化。

在其生物活性成分中，表小檗碱（EPI）是一种从黄连中提取的关键生物碱，据报道在T2DM模型中可改善高血糖、高脂血症、氧化应激和IR，并对蛋氨酸和胆碱缺乏饮食诱导的MASH发挥保护作用。然而，黄连及其活性代谢物EPI对T2DM相关MASH的潜在治疗作用尚未得到系统研究。

在本研究中，我们建立了T2DM相关MASH小鼠模型，以模拟代谢-免疫失调的肝脏微环境。通过结合体内药理学方法、免疫学测定和体外分子生物学技术，我们旨在验证黄连和EPI对肝脏病理、糖脂代谢和炎症的治疗效果，并阐明其潜在机制，特别关注IL-17RA/核因子κB（NF-κB）信号通路。

材料与方法

试剂

链脲佐菌素（STZ，纯度≥98%）、IL-17A（纯度≥98%）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、3,3'-二氨基联苯胺四盐酸盐（DAB）、二甲基亚砜（DMSO）和DMEM高糖完全培养基购自Sigma-Aldrich。EPI（纯度≥98%）由MedChemExpress提供。戊巴比妥购自维科奇生物技术有限公司。热灭活胎牛血清（FBS）购自Cytiva-HyClone Laboratories Inc.。高脂饮食（HFD）购自江苏协同医药生物工程有限公司。苏木精-伊红（H&E）染色剂购自Solarbio科技股份有限公司。丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）、总胆红素（T-Bil）、TG和葡萄糖试剂盒购自Olympus。胰岛素（INS）、IL-6、IL-1β、IL-12p40和肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自Abcam。引物由Biomed合成。逆转录试剂盒和定量实时聚合酶链反应（qPCR）试剂盒购自TaKaRa。针对IL-17RA（兔多克隆）、核因子κB激活剂1（Act1，兔单克隆）、肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6，兔单克隆）、NF-κB p65（兔单克隆）、山羊抗兔IgG（多克隆）的抗体和TRIzol购自Invitrogen。

黄连水煎剂的制备

黄连（毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎）取自甘肃中医药大学附属医院。该生药材源自中国四川（批号：D2405047；生产日期：20240508），是道地药材，并由甘肃中医药大学药学院鉴定。

我们采用水煎提取法进行煎煮和浓缩，这是中药提取草药的传统方法之一。根据先前的研究，将干燥黄连（9.0 g）粉碎，过2.0 mm筛，与30倍量（w/v）蒸馏水混合，煮沸30分钟。提取两次，合并滤液，在室温下以4,000 g离心10分钟。上清液在减压下浓缩至最终体积150 mL，得到最终浓度为60 mg/mL。将黄连水煎剂分装并在-20°C保存直至使用。

在临床应用黄连治疗T2DM时，黄连的剂量通常范围从9 g到30 g，取决于病情严重程度。小鼠的剂量（1.17 g/kg/d）是根据“人与动物体表面积等效剂量比值表”确定的，对应于成人T2DM常用临床剂量9 g/天。

动物模型和药物干预

实验设计如图所示。六十只SPF级雄性C57BL/6J乳鼠购自兰州大学实验动物中心。根据先前的研究，十二只小鼠被分配到正常对照组（NC），并在2日龄时皮下注射0.9%生理盐水（NS：20 μL/只），在4周龄断奶后接受正常饮食，并在整个实验期间维持。其余48只小鼠在2日龄时皮下注射STZ（200 μg/20 μL/只），并在4周龄断奶后饲喂HFD以诱导T2DM相关MASH模型，并在整个实验期间维持。

在5周龄时，空腹血糖（FBG）水平>11.0 mM的小鼠被认为是糖尿病小鼠并被纳入研究。将这48只小鼠随机分为四组（每组n=12）：模型对照组（MC）、低剂量黄连治疗组（LCR，0.585 g/kg/d）、中剂量黄连治疗组（MCR，1.17 g/kg/d）和高剂量黄连治疗组（HCR，2.34 g/kg/d）。NC和MC组接受等体积蒸馏水。所有治疗均通过口服灌胃进行，每天两次，持续4周（即直至9周龄）。所有小鼠在SPF条件下饲养，12小时黑暗/光照周期，实验期间自由获取食物和水。所有动物实验均严格按照动物实验实验室指南进行。本研究经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准（批准号：2021-036）。

样品制备

末次灌胃后，小鼠禁食12小时，自由饮水。通过腹腔注射3%戊巴比妥麻醉小鼠。从腹主动脉采集血液并离心获得血清。从同一部位解剖肝组织，制备肝病理切片用于组织病理学分析和肝匀浆。

原代肝细胞制备

参照Song等人（2021）的方法，在4°C无菌条件下使用酶消化法从小鼠肝组织中分离原代肝细胞。将细胞重悬于补充有10%（v/v）FBS、青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 μg/mL）的DMEM高糖培养基中，并在涂有I型大鼠尾胶原的培养皿中，在37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养。通过台盼蓝排斥法评估细胞活力（>90%存活）。

细胞培养和IL-17A诱导

IL-17A和EPI分别溶解于PBS和DMSO中，并储存于4°C。培养12小时后，收集原代肝细胞，并通过台盼蓝排斥法确认细胞活力（>90%存活）。

实验1. 来自NC、MC、LCR、MCR和HCR组的原代肝细胞接种到新的培养皿中（1×10⁵细胞/皿），并用含有10%（v/v）FBS、青霉素、链霉素和IL-17A（最终浓度100 ng/mL）的DMEM高糖培养基处理24小时。收集无细胞上清液用于促炎细胞因子分析。

实验2. 来自MC组的原代肝细胞分为两组：空白对照（BC）和EPI预处理（EP），每皿1×10⁵个细胞。细胞用DMSO（BC）或EPI（100 μmol/L，EP）预处理12小时，随后用IL-17A（100 ng/mL）刺激另外24小时。收集细胞沉淀和无细胞上清液用于mRNA表达和促炎细胞因子分泌分析。每个实验重复三次。

RNA提取和qPCR分析

使用TRIzol试剂按照制造商说明书提取总RNA。使用260 nm和280 nm吸光度比值（A260/280）评估RNA纯度。测量A260以确定RNA浓度。使用随机引物从1 μg总RNA合成cDNA。使用Bio-Rad IQ5系统和SYBR Green Premix Ex Taq进行qPCR，遵循2^?ΔΔCt方法。热循环程序如下：95°C 5分钟，随后35个循环：95°C 10秒，55°C 20秒，72°C 20秒。使用熔解曲线分析确认扩增特异性。引物序列列于表中。每个样品重复运行两次。β-肌动蛋白用作内参。

免疫组织化学分析

免疫组织化学（IHC）分析按照先前报告进行。肝组织切片（5 μm）脱蜡、水化并进行抗原修复。切片在4°C overnight孵育以下一抗：兔多克隆抗IL-17RA（2.5 μg/mL）、兔单克隆抗Act1（2.0 μg/mL）、兔单克隆抗TRAF6（1.8 μg/mL）和兔单克隆抗NF-κB p65（2.0 μg/mL）。用兔血清代替一抗孵育阴性对照样品。洗涤后，切片与生物素化山羊抗兔IgG孵育，随后与过氧化物酶标记的链霉亲和素孵育。使用DAB进行显色，切片用苏木精复染。棕黄色染色表明阳性免疫反应性。最后，在显微镜下观察切片，并使用Image-Pro Plus（v.6.0）软件量化积分光密度（IOD）值/面积，以分析蛋白表达水平的差异。

组织病理学分析

固定的肝组织通过乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，并切成4 μm厚切片。按照标准方案进行H&E染色。根据Kleiner等人（2005）的标准计算非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）活动度评分（NAS）。

生化测定

使用市售试剂盒，通过比色法使用Olympus AU 640化学分析仪测量血清ALT、AST、GGT、T-Bil、TG、FBG和肝TG水平。所有样品重复运行三次。

IR评估

使用ELISA试剂盒按照制造商方案测量血清INS，使用ELx800 BioTek ELISA读数器在450 nm读数。根据公式空腹INS（mIU/L）× FBG（mmol/L）/22.5通过稳态模型评估的IR（HOMA-IR）指数确定IR，该公式先前已针对钳夹测量进行验证。

ELISA

使用ELISA试剂盒按照制造商方案测量肝匀浆和细胞培养上清液中IL-6、IL-1β、IL-12p40和TNF-α的水平。使用ELx800 BioTek ELISA读数器在450 nm测量光密度。所有样品重复运行三次。

统计分析

使用SPSS 13.0版进行数据分析。连续变量以均值±SD汇总。进行方差齐性检验和单因素方差分析。如果方差齐性且拒绝零假设，则使用LSD-t检验比较多组；如果方差异质，则使用Tamhane's T2检验比较多组。所有统计分析均基于显著性水平为0.05的双侧假设检验。

结果

黄连改善了T2DM相关MASH小鼠的肝脏功能和组织学病变

如图所示，T2DM相关MASH小鼠表现出显著的肝功能不全，证据是血清ALT、AST、GGT和T-Bil水平显著高于NC组（所有p < 0.001）。黄连治疗以剂量依赖性方式显著降低了这些肝损伤标志物（所有p < 0.001），表明存在明显的量效关系。

NAS是组织学严重程度的指标。MC组的NAS平均值与中度脂肪性肝炎阶段一致。数据显示，MC组的NAS显著高于NC组和黄连治疗组（所有p < 0.05）。黄连治疗以剂量依赖性方式显著降低了NAS（p < 0.05）。

组织病理学分析显示，T2DM相关MASH小鼠出现明显的肝细胞水肿、大量脂滴积累和肝小叶内炎症细胞浸润，本研究未观察到明显的肝纤维化。黄连治疗以剂量依赖性方式显著改善了这些病理变化，HCR组显示出最显著的改善。

黄连改善了T2DM相关MASH小鼠的糖脂代谢紊乱

如图所示，T2DM相关MASH小鼠表现出显著的代谢失调，包括FBG、INS、HOMA-IR指数以及血清和肝TG水平升高，与NC组相比（所有p < 0.001）。黄连治疗以剂量依赖性方式显著改善了这些代谢参数（所有p < 0.001），表明其在恢复糖脂稳态中具有有益作用。

黄连降低了T2DM相关MASH小鼠肝脏中促炎细胞因子水平

如图所示，肝脏促炎细胞因子水平，包括IL-6、IL-1β、IL-12p40和TNF-α，在MC组中显著高于NC组（所有p < 0.001）。黄连治疗显著降低了这些细胞因子的水平（所有p < 0.001）。在LCR、MCR和HCR组中也观察到明显的剂量依赖性降低（所有p < 0.001）。

黄连下调了T2DM相关MASH小鼠肝脏中的IL-17RA/NF-κB信号通路

如图所示，与NC组相比，MC组中IL-17RA/NF-κB信号通路组分的mRNA表达水平显著上调（IL-17RA：约6.79倍；Act1：约7.71倍；TRAF6：约5.96倍；NF-κB：约6.99倍；所有p < 0.001）。黄连治疗显著降低了IL-17RA、Act1、TRAF6和NF-κB的mRNA表达水平，与MC组相比（所有p < 0.005），治疗组之间存在统计学显著的剂量依赖性效应（p < 0.05）。

IHC分析进一步证实，与NC组相比，MC组中IL-17RA、Act1、TRAF6和NF-κB p65的蛋白表达水平显著增加。黄连治疗以剂量依赖性方式下调了这些蛋白的表达，HCR组显示出对IL-17RA/NF-κB通路表达最显著的抑制（所有p < 0.001）。

黄连在体外抑制了T2DM相关MASH小鼠原代肝细胞中IL-17A诱导的促炎细胞因子分泌

如图所示，与NC组相比，IL-17A刺激显著增加了源自T2DM相关MASH小鼠的原代肝细胞在体外分泌IL-6、IL-1β、IL-12p40和TNF-α（所有p < 0.001）。黄连治疗显著抑制了IL-17A诱导的这些细胞因子的分泌（所有p < 0.001），并且抑制效果随着黄连剂量的增加而增强（所有p < 0.005）。

EPI在体外下调了T2DM相关MASH小鼠原代肝细胞中的IL-17RA/NF-κB信号通路

如图所示，与BC组相比，EPI显著降低了T2DM相关MASH小鼠原代肝细胞中IL-17RA、Act1、TRAF6和NF-κB的mRNA表达水平（IL-17RA：约0.43倍，p < 0.001；Act1：0.39倍，p = 0.001；TRAF6：0.56倍，p = 0.014；NF-κB：0.42倍，p = 0.002）。

EPI在体外抑制了T2DM相关MASH小鼠原代肝细胞中IL-17A诱导的IL-17RA/NF-κB信号通路激活

如图所示，EPI显著抑制了T2DM相关MASH小鼠原代肝细胞中IL-17A诱导的IL-6、IL-1β、IL-12p40和TNF-α的分泌（p < 0.05或p < 0.001），证明了其在体外减轻IL-17RA/NF-κB介导的肝脏炎症的作用。

讨论

近年来，T2DM相关MASH因其日益增长的患病率和进行性肝损伤（包括肝纤维化、肝硬化和HCC）的潜力而成为日益增长的临床关注点。尽管具有临床重要性，但在真实世界环境中，针对T2DM相关MASH的靶向且有效的药理学治疗策略仍然有限，这主要是由于代谢失调和免疫介导的肝损伤之间复杂的相互作用。

尽管resmetirom作为首个FDA批准的用于MASH伴肝纤维化的治疗药物显示出前景，但其在T2DM患者中的疗效尚未完全阐明。值得注意的是，关键III期RCT中相当大比例的参与者表现出良好的血糖控制和有限的糖尿病相关并发症。相比之下，真实世界的T2DM人群通常表现为血糖控制不佳、血管合并症和治疗依从性不理想。根据美国糖尿病协会，在美国只有22.2%的T2DM成年患者对血糖、血压和血浆非高密度脂蛋白胆固醇有满意控制。类似地，中国的一项全国调查报道，仅有20.1%的T2DM成年患者达到血糖和血压的最佳控制。考虑到真实世界与RCT之间的差异，resmetirom对T2DM相关MASH的实际临床效果可能偏离RCT结果，并且可能不能完全推广。因此，迫切需要开发更安全、更有效的治疗策略，以同时解决T2DM相关MASH中的糖脂代谢功能障碍、IR和肝脏炎症。

鉴于T2DM相关MASH的多因素发病机制，针对单一通路或分子靶点通常不足以实现全面的疾病控制。相比之下，多靶点、多层面、多角度的治疗剂——尤其是源自天然产物的治疗剂——可以调节疾病网络的各个组成部分，从而提高T2DM相关MASH的治疗效果并减少不良反应。

黄连是毛茛科黄连属药用植物（如黄连）的干燥根茎，在中医中已广泛使用一千多年，用于治疗“消渴”症，相当于现代医学中的DM，主要症状为“多饮、多尿、多食、消瘦和疲劳”。在植物化学上，已从黄连中分离鉴定出120多种生物活性代谢物，包括生物碱、有机酸、木脂素、黄酮和挥发油，它们共同贡献了其多靶点药理学特征。

近几十年来，越来越多的证据表明黄连作为T2DM和T2DM相关MASH的补充和替代疗法的潜力。它已被证明可以调节FBG、改善血脂谱、减少IR并减轻肝细胞中的脂质积累，并且具有良好的安全性。在其生物活性代谢物中，EPI是一种从黄连中提取的主要生物碱，据报道通过保护T2DM免受氧化应激来缓解IR，并通过上调小异二聚体伴侣和抑制SREBP1/FASN通路来抑制肝TG合成从而改善肝脏脂肪变性。然而，先前大多数关于黄连的研究都是基于中药复方进行的，因此很难清楚阐明黄连本身或其单个活性代谢物对T2DM相关MASH的作用和机制。

越来越多的证据表明IL-17A信号在T2DM相关MASH的发病机制中起作用，突出了IL-17RA/NF-κB轴作为一个有前景的治疗靶点。在本研究中，我们建立了一个T2DM相关MASH小鼠模型，该模型密切模拟了临床环境中观察到的代谢-免疫失调的肝脏微环境，从而更好地反映了在T2DM条件下从单纯脂肪变性到MASH的进展。

我们的研究首次揭示，黄连通过在下调和整体水平上下调IL-17RA/NF-κB信号通路，有效改善T2DM相关MASH。当IL-17A（由Th17细胞分泌）与其受体IL-17RA结合后，通过Act1、TRAF6和NF-κB的下游信号被激活，导致促炎细胞因子的转录并加剧肝脏炎症和损伤。我们证明黄连治疗以剂量依赖性方式显著降低了IL-17RA、Act1、TRAF6和NF-κB的表达，从而减轻了炎症反应并改善了肝脏病理。在三个临床相关剂量的黄连中观察到治疗效果，对应于成人T2DM患者典型的人每日剂量范围4.5 g–18 g。在活性代谢物中，EPI在介导这些效应中起关键作用。我们的体外研究进一步证实，EPI抑制了IL-17A诱导的促炎细胞因子分泌，并下调了原代肝细胞中关键IL-17RA/NF-κB通路组分的表达。说明了黄连和EPI改善T2DM相关MASH机制的示意图如图所示。

中医长期以来被用于管理代谢疾病，许多植物药在治疗T2DM及其并发症（包括MASH）方面显示出前景。诸如山茱萸、剑叶龙血树、人参、桑葚和乌龙茶等植物药在临床前和临床研究中已证明具有潜在益处。尽管植物药多样且复杂的化学成分使得定义精确的分子靶点具有挑战性，但其整体效应已显示出可靠的治疗效果。黄连作为中医糖尿病方剂中最广泛使用的草药成分之一，作为T2DM相关MASH的安全有效的补充或替代疗法具有巨大潜力。然而，有限的研究集中于其作为单一植物药的使用，这突出了当前研究的一个重要空白。我们的研究提供了新的证据支持黄连的治疗潜力，并确定EPI作为介导其抗炎和代谢调节作用的关键生物活性成分。这些发现为未来开发基于证据的单一草药或成分基础的T2DM相关MASH治疗策略奠定了坚实的基础。

在后续研究中，将给T2DM相关MASH小鼠注射EPI（相当于黄连提取物中的EPI剂量）以评估其对肝功能、代谢指标和通路的影响，直接验证EPI的体内功效，同时鉴定和审查黄连中的其他特定活性代谢物，以确定它们个体贡献和在改善T2DM相关MASH中的潜在协同效应。这些后续研究将增进我们的理解，并增强黄连作为T2DM相关MASH治疗策略的潜力和转化。

尽管有这些有前景的发现，但本研究存在一些局限性。我们主要关注IL-17RA/NF-κB通路和EPI在介导黄连治疗效果中的作用。黄连的其他潜在生物活性成分，如小檗碱，也可能通过独特或协同机制贡献其药理学效应，这些尚未阐明。

在未来的研究中，我们计划直接评估EPI在相当于黄连提取物所提供剂量下的体内功效。我们还将研究黄连的其他主要活性成分，以确定它们个体和联合对整体治疗效果的贡献。这些努力将进一步增进我们对黄连作为T2DM相关MASH转化治疗策略的理解，并支持其发展成为临床可行的治疗选择。

结论

本研究表明，黄连改善了STZ和HFD诱导的小鼠T2DM相关MASH。黄连被证明可抑制IL-17RA/NF-κB信号通路，促进肝脏组织学和功能恢复，并改善糖脂代谢和IR，且效果呈现明显的量效关系。这些治疗效果与其活性代谢物EPI密切相关。