基于全基因组关联分析挖掘箭筈豌豆生物量性状遗传位点及KASP标记开发

本推荐旨在介绍一项针对箭筈豌豆（Vicia sativa L.）生物量性状的全基因组关联分析（GWAS）研究。该研究通过对172份种质资源进行重测序，鉴定出33个与鲜重、干重、株高等性状显著关联的新位点，并成功开发出可用于分子标记辅助选择（MAS）的KASP标记，为高生物量箭筈豌豆育种提供了宝贵的遗传资源和分子工具。

　　

引言

箭筈豌豆（Vicia sativa L.）是一种豆科植物，在亚洲、欧洲和美洲广泛种植，主要用作饲料作物和绿肥。作为一种重要的饲草作物，其粗蛋白含量可达18–22%，是牛羊的优质饲料；同时具备强大的固氮能力，可有效改善土壤肥力。因此，提高生物量相关性状成为箭筈豌豆育种的重要目标。目前全球箭筈豌豆种植面积约54万公顷，主要生产国包括俄罗斯、中国和澳大利亚。中国自20世纪50年代引种以来，主要在西北、华北及西南高海拔地区种植，总面积约50万公顷，干草产量可达6–15吨/公顷，种子产量1.2–2.5吨/公顷。

随着二代测序（NGS）技术的发展，基于DNA序列变异的分子标记，特别是单核苷酸多态性（SNP），因其高密度和高通量检测能力成为遗传分析的主流选择。2022年，箭筈豌豆染色体级别参考基因组的发布使得利用NGS进行SNP发现变得经济高效。分子标记辅助选择（MAS）通过利用与目标基因紧密连锁的分子标记进行早期选择，可显著缩短育种周期。典型的MAS流程通常包括：通过全基因组关联研究（GWAS）识别候选区域，开发竞争性等位基因特异性PCR（KASP）标记，最后将这些标记应用于育种项目。KASP是一种高通量、低成本的基因分型技术，以其快速、可靠的特点在水稻、小麦和玉米等主要作物中广泛应用，但在箭筈豌豆中的应用尚未见报道。

材料与方法

研究收集了172份箭筈豌豆种质资源，来自18个国家，其中中国种质108份（占62.8%），俄罗斯29份（16.9%），其余来自乌克兰、西班牙、澳大利亚等国。所有材料于2020–2023年种植于黑龙江省哈尔滨市，采用随机区组设计，每个小区设三次重复。

评估的生物量相关性状包括鲜重（FW）、干重（DW）、单株鲜重（PFW）、单株干重（PDW）和株高（PH）。在盛花期，每个小区随机选取10株测量株高；同时随机选取三个1米样段（排除边行）测定鲜重，随后将鲜样置于105°C烘箱中30分钟以灭酶，再于70°C下烘干至恒重记录干重。

全基因组重测序采用PE150测序，共产生3,766.95 Gb原始数据，有效数据率达98.95%。清洁数据通过BWA（v0.7.8）比对至参考基因组（GCF_026540005.1），并使用GATK HaplotypeCaller（v4.0.10.1）进行SNP calling。过滤后保留4,796,342个高质量SNP，平均密度为2,904.6 SNPs/Mb。

群体结构分析使用ADMIXTURE（v1.3.0）进行，主成分分析（PCA）和邻接树构建使用TASSEL v5.0。GWAS采用混合线性模型（MLM），包含亲缘关系矩阵和主成分作为协变量。由于Bonferroni-Holm校正过于保守，本研究将调整后的 -log₁₀（P值）≥5.0视为显著关联。

KASP引物根据已发表方法设计，反应体系包含46 μL无菌蒸馏水、12 μL带尾引物（100 μM）和30 μL通用引物（100 μM）。热循环条件包括：95°C初始变性15分钟，随后10个触摸循环（94°C 20秒；退火从65°C开始，每个循环降低0.8°C，持续25秒）和10个扩增循环（94°C 20秒；55°C 60秒）。

选取19个与生物量性状相关的候选基因，利用极端表型材料建立高、低混池进行表达分析。使用HiScript II合成cDNA，Primer 5.0设计基因特异性引物。定量PCR（总体积20 μL）包含2 μL cDNA、10 μL SYBR Green master mix（ChamQ Universal）和0.4 μL各引物（10 μM）。以actin为内参基因，采用2^?ΔΔCt法计算相对表达量。

结果

全基因组重测序与SNP特征

对172份箭筈豌豆种质进行全基因组重测序，共鉴定出4,796,342个高质量SNP，分布于所有6条染色体，平均密度为2,904.6 SNPs/Mb。染色体1的SNP数量最多（1,040,667个），密度为3,204.4 SNPs/Mb；染色体2次之（1,011,653个，密度3,117.0 SNPs/Mb）；染色体4密度最高（923,806个SNP，密度3,184.4 SNPs/Mb）；染色体3多态性最低（679,356个，密度2,337.1 SNPs/Mb）；染色体5和6分别包含712,272和428,588个SNP，密度分别为2,613.9和2,882.7 SNPs/Mb。

群体结构分析

群体结构分析将172份种质划分为4个亚群（POP1–POP4）。POP1包含95份种质，主要来自中国、俄罗斯和欧洲，表明其广泛的适应性；POP2包含50份种质，以中国种质为主，显示局部遗传同质性；POP3（15份）和POP4（12份）也主要来自中国，但包含少量欧洲和澳大利亚种质，提示可能存在遗传隔离或独特适应性。系统发育和主成分分析（PCA）验证了这些分组。

表型分析显示亚群间存在显著差异。POP1亚群株高最高（113.4厘米），显著高于POP4（78.7厘米）；同时，POP1的单株鲜重最高（198.8克），显著高于其他亚群。但各亚群间单株干重无显著差异。鲜重和干重方面，POP1（36.4吨/公顷和6.3吨/公顷）显著高于POP2、POP3和POP4，后三者间无显著差异。

生物量性状的表型变异与GWAS

在四个环境中对172份箭筈豌豆种质的5个生物量相关性状进行了评估。平均株高为101厘米（标准差18.2厘米，变异系数0.181）；平均单株鲜重184.0克（标准差47.0克，变异系数0.255）；平均单株干重36.9克（标准差6.36克，变异系数0.172）；鲜重产量28.0吨/公顷（标准差9.92吨/公顷，变异系数0.353）；干重产量5.05吨/公顷（标准差1.48吨/公顷，变异系数0.293）。方差分析表明，基因型、环境及基因型×环境互作对每个生物量性状均有显著影响（P<0.01）。株高、单株鲜重、单株干重、鲜重和干重的广义遗传力（H_b²）估计值分别为0.68、0.65、0.65、0.62和0.63。单株鲜重、鲜重和干重与株高呈显著正相关（r分别为0.28、0.74和0.70），鲜重与干重也呈显著正相关（r=0.97）。

GWAS共鉴定出33个显著位点。对于干重，在染色体1、2、4、5和6上发现7个显著位点，表型变异解释率（PVE）为11.6%至17.1%，其中qDW4.3贡献最大。对于鲜重，在染色体1、2、4、5和6上发现7个关联位点，PVE为11.9%至22.5%，其中qFW5.1的PVE最高（22.5%）。qDW4.3是遗传跨度最大的位点，接近23.1 Mb，单倍型分析表明该区域形成一个单倍型块，可能位于重组事件较少的区域，暗示存在重要质量性状。对于单株干重，在染色体1、4和5上鉴定出4个显著位点，PVE为11.6%至14.9%。对于单株鲜重，在染色体1、2和4上发现7个显著关联位点，PVE为11.6%至16.8%。对于株高，在染色体1、2、3、4、5和6上发现9个位点，PVE为11.6%至14.9%。

此外，还鉴定出多个具有多效性的位点。例如，qPDW1.2和qPFW1.3共同定位于染色体1的285.8–292.8 Mb；qPH2.1和qFW2.1共同定位于染色体2的283.4–285.6 Mb；在染色体4上，qDW4.1和qFW4.1共同定位于83.0–83.9 Mb；在染色体6上，qDW6.1和qFW6.1共同定位于5.4–7.7 Mb。

候选基因的鉴定与功能分析

基于遗传区域、基因注释和模式物种中的功能网络，共鉴定出19个与箭筈豌豆生物量相关的候选基因。其中，jg20144（qPH5.1）、jg53159（qPH3.1）和jg38331（qFW1.1）编码ABC转运蛋白家族蛋白；jg28336（qPFW4.1）与纤维素合酶A催化亚基相关；jg36211（qPFW4.2）对应蛋白质纤维素合酶相互作用蛋白3；jg54309（qPH3.2）编码F-box蛋白；jg5441（qPFW2.2）编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶7长形同源物；jg40897（qPFW1.2）与xenla sigma非阿片细胞内受体1相关；jg4542（qPFW2.1）和jg41157（qPH1.1）参与细胞分裂素羟化酶合成；jg35082（qPH4.2）和jg35546（qFW4.2）与细胞分裂素核苷5’-单磷酸磷酸核糖水解酶相关；jg4047（qPH6.1）、jg38379（qFW1.1）和jg493（qDW6.1）与乙烯响应转录因子WRI1OS相连；jg29235（qPH4.1）与脱落酸8’-羟化酶4相连；jg52548（qPH3.1）与脱落酸受体相关；jg20169（qPH5.1）编码生长素响应蛋白；jg37885（qPFW1.1）与油菜素内酯不敏感1相关受体激酶1相关。

qRT-PCR验证显示，15个候选基因在极端表型混池中表达量存在显著差异。jg493、jg37885、jg5441、jg29235、jg52548、jg35546、jg36211、jg28336、jg20144、jg54309和jg53159在对应性状值较大的材料中表达量分别高出2.95倍和4.47倍；而jg20169、jg38379、jg35082和jg41157在对应性状值较小的材料中表达量分别高出2.77倍和5.26倍。jg4047、jg40897、jg4542和jg38331在极端材料间无显著表达差异。

KASP标记的开发与验证

为支持箭筈豌豆MAS育种，选择了4个具有稳定或高PVE的SNP位点转化为KASP标记。其中，仅位于qDW1.1遗传区间内的一个SNP成功转化为功能性KASP标记，命名为Kasp-DW1.1。基因型一致性分析显示，Kasp-DW1.1与重测序数据的吻合度超过90.1%。在自然群体中的验证表明，携带有利等位基因（CC，63份）的材料干重（平均值5.40）显著高于携带不利等位基因（AA，75份；平均干重4.74）的材料（P<0.05）。

讨论

迄今为止，关于箭筈豌豆生物量相关性状的遗传分析研究有限，尚无可用于育种实践的分子标记。随着参考基因组的发布、重测序技术的进步、基因分型芯片的发展以及KASP技术的成熟，本研究利用GWAS方法，基于172份箭筈豌豆品种研究了5个生物量相关性状的遗传架构。

172份箭筈豌豆种质可分为4个亚群，群体结构通过系统发育分析和群体结构验证。这些发现与先前研究一致，即中国箭筈豌豆品种大致分为两或三个 distinct 群体，其中西北群体与欧洲种质遗传亲缘更近，而西南群体表现出独特的适应性状。结果强调了与地理起源相关的显著遗传结构，为不同地区改良箭筈豌豆品种提供了宝贵见解。

统计分析显示亚群间生物量相关性状存在显著差异，表明箭筈豌豆发生了适应性进化。POP1亚群植株最高（株高113.4厘米）、鲜重产量最高（36.4吨/公顷），表明该亚群经过自然选择增强了光合能力，可能更适应高肥力和水分充足的环境，具有更高的产量潜力。相比之下，其他亚群植株较矮（株高78.7–98.3厘米）、鲜重产量较低（20.1–22.3吨/公顷），可能由于优先考虑抗逆性（如抗旱或抗风）或根系生长，使其更适应生物和非生物胁迫环境。总之，POP1亚群更适应高肥力和水分充足的环境，具有更高产量潜力；其他三个亚群更适应严峻的非生物胁迫环境，表现出更好的抗逆性。

本研究在四个环境中对172份箭筈豌豆种质进行了GWAS，以研究5个生物量相关性状。箭筈豌豆的生物量相关性状通常受数量遗传控制，由多个微效基因控制。关联作图使用所有四个环境中每个性状的最佳线性无偏预测（BLUP）值进行。因此，本研究中鉴定的33个位点均代表新发现，特别是针对这5个生物量相关性状。长期以来，关于箭筈豌豆生物量相关性状遗传机制的研究有限，且没有相关遗传位点的明确报道。此外，本研究利用重测序和衍生的SNP标记，这与SSR标记等传统标记不同。因此，所有33个位点均代表新发现。这些结果为未来研究箭筈豌豆生物量相关性状的遗传机制提供了宝贵见解。

共鉴定出15个与生物量相关性状相关的候选基因。其中，jg20144（qPH5.1）和jg53159（qPH3.1）编码ABC转运蛋白，已知参与植物激素和次级代谢物的运输，对调节植物生长至关重要。jg28336（qPFW4.1）编码纤维素合酶，是纤维素合成的关键酶，对初生和次生细胞壁的形成至关重要，影响植物形态和整体生长。jg54309（qPH3.2）编码F-box蛋白，已知调节激素信号传导、光形态建成和开花时间，其底物特异性确保了对发育转换和胁迫适应的精确时间控制。jg5441（与qPFW2.2相关）编码丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，通过调节其他蛋白的活性，在细胞周期进程、信号转导和激素信号传导中起关键作用。

植物激素核心调控生长的各个方面。例如，生长素对种子萌发、生长发育、开花、果实成熟和叶片脱落等过程至关重要；赤霉素促进茎伸长、打破种子休眠、刺激萌发和增强果实发育；细胞分裂素主要促进细胞分裂、延缓叶片衰老，并与生长素协调调节根和芽分化；脱落酸抑制生长、促进休眠和器官脱落，并在胁迫条件（如干旱）下积累，诱导气孔关闭以减少水分损失；乙烯促进果实成熟、器官脱落和衰老，高浓度生长素可能刺激其合成；油菜素内酯是较新表征的一类植物激素，促进细胞伸长和分裂、增强抗逆性（如抗病和抗寒性），并可能与生长素和赤霉素发挥协同作用。在此背景下，鉴定出10个候选基因：jg38379（qFW1.1）和jg493（qDW6.1）编码乙烯响应转录因子；jg41157（qPH1.1）和jg36211（qPFW4.2）编码细胞分裂素羟化酶；jg35082（qPH4.2）和jg35546（qFW4.2）编码细胞分裂素核苷5’-单磷酸磷酸核糖水解酶；jg29235（qPH4.1）和jg52548（qPH3.1）编码脱落酸受体；jg20169（qPH5.1）编码生长素响应蛋白；jg37885（qPFW1.1）编码油菜素内酯不敏感1相关受体激酶。

箭筈豌豆KASP引物设计失败的主要原因如下：（1）箭筈豌豆基因组中重复序列比例较大。若SNP位点位于重复序列、低复杂度区域或旁系同源基因附近，很可能导致非特异性结合。此外，高GC/AT含量也增加了设计难度。（2）尚未建立适合箭筈豌豆的可靠扩增程序。目前程序仍主要参考小麦，可能退火温度等设置不合理导致扩增不成功。（3）引物长度或Tm值设计不当可能导致引物无效结合或扩增，也可能导致二聚体或发夹结构形成。（4）箭筈豌豆基因组于2022年发布，尚无更新版本，基因组注释可能存在缺陷，导致引物设计失败。

KASP检测与重测序结果基因型不完全匹配的原因包括：首先，KASP标记检测基于等位基因特异性PCR技术，使用特异性引物和荧光探针区分特定SNP位点基因型，适用于已知位点的快速基因分型；重测序则需要片段化DNA、构建测序文库，使用高通量测序平台（如Illumina、PacBio、Oxford Nanopore）对文库进行测序，生成大量原始测序数据，去除低质量读长和接头序列后，将测序读长比对至参考基因组（使用BWA、Bowtie）以确定其基因组位置，基于比对结果识别样本与参考基因组之间的遗传差异，包括SNP、InDel、SV（使用GATK、Samtools）。其次，某些SNP位点可能位于重复序列、结构变异区域或高多态性区域，KASP引物可能无法特异性结合或有效扩增，重测序可识别这些复杂区域的变异，提供更准确的基因型信息。第三，KASP结果解读依赖于设