利用缺氧芯片模型探究左西孟旦（Levosimendan）及其代谢物OR-1896在缺血性人iPSC源性心肌细胞中的抗心律失常与心肌保护作用

本研究利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（hiPSC-CMs）构建体外缺氧模型，首次系统评估了左西孟旦（Levosimendan）及其长效活性代谢物OR-1896在急性缺氧条件下的心肌保护与抗心律失常作用。研究证实二者可显著改善钙瞬变（Ca2+ transients）、减轻结构损伤、下调缺氧相关基因（如HIF-1α、HMOX1），并降低心肌损伤标志物（cTnT、proBNP）释放，为缺血性心脏病（IHD）的药物干预提供了新策略。

　　

引言

缺血性心脏病（Ischemic Heart Disease, IHD）是全球发病和死亡的主要原因，其最严重的表现形式是急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI），可导致不可逆的心肌损伤和危及生命的心律失常。目前临床除β受体阻滞剂外，缺乏有效预防或治疗缺血相关心律失常的药物。左西孟旦（Levosimendan）作为一种钙增敏剂，兼具正性肌力和血管舒张作用，已被用于急性失代偿性心力衰竭的治疗。其在体内经肠道菌代谢后生成中间产物OR-1855，进一步乙酰化形成具有生物活性的代谢物OR-1896。本研究旨在利用人诱导多能干细胞来源的心肌细胞（human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs）建立缺氧模型，系统评价左西孟旦及其代谢物OR-1896在缺氧条件下的心肌保护与抗心律失常效应。

材料与方法

研究采用健康女性来源的UTA.04602.WT hiPSC细胞系，通过胚胎体（Embryoid Body, EB）法分化为心肌细胞，并经磁激活分选技术（MACS）纯化。细胞接种于预涂明胶的OxyGenie单室培养腔室，密度为10–15万/腔，培养7–10天后进行实验。

实验分为四组：常氧对照组、缺氧对照组、缺氧+左西孟旦处理组、缺氧+OR-1896处理组。左西孟旦与OR-1896均以二甲基亚砜（DMSO）配制为10 mM储备液，工作浓度为2 μM。药物预处理15分钟后开始缺氧实验。

缺氧通过OxyGenie迷你培养系统实现，使用混合气体（0% O₂, 5% CO₂, 95% N₂）以5 mL/min/腔的流速供应。钙成像实验缺氧时长为7小时，于0、4、7小时记录；结构染色、电镜及基因表达实验则缺氧24小时。

细胞结构通过免疫细胞化学评估，抗体包括HIF-1α、α-actinin、肌钙蛋白T（troponin T）和肌球蛋白结合蛋白C（myosin-binding protein C）。超微结构通过透射电镜观察。钙瞬变使用Cal-520? AM荧光染料记录，通过Axio Observer显微镜系统采集图像，Clampfit软件分析参数。心肌肌钙蛋白T（cTnT）和N末端脑钠肽前体（proBNP）通过ELISA试剂盒测定。基因表达通过qRT-PCR与TaqMan? Human Hypoxia Array检测，数据以GAPDH为内参，采用2^?ΔΔCt法分析。

数据以均值±标准误表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）或非参数Kruskal–Wallis检验，事后分析使用Tukey或Dunn’s检验，并做Bonferroni校正。

结果

缺氧对hiPSC-CMs结构的影响及左西孟旦与OR-1896的保护作用

常氧条件下，hiPSC-CMs表现出良好的结构完整性，包括整齐排列的肌节、完整的Z盘、有组织的肌原纤维、线粒体嵴结构清晰、细胞核形态正常。而缺氧24小时后，细胞出现明显结构破坏：肌节排列紊乱、Z盘降解、肌原纤维断裂、线粒体嵴碎片化、核染色质凝聚和核收缩。免疫染色显示，缺氧组HIF-1α表达显著上调，α-actinin、肌钙蛋白T和肌球蛋白结合蛋白C的细胞骨架结构严重破坏。

经左西孟旦或OR-1896处理后，缺氧诱导的结构损伤显著减轻。肌节排列更为整齐，Z盘和肌原纤维结构得到保护，线粒体嵴和膜完整性接近常氧水平，核形态也未见明显应激改变。值得注意的是，两种处理均未显著改变HIF-1α的表达水平，表明其保护作用可能不依赖于HIF-1α通路。

缺氧对钙循环的影响及药物的抗心律失常作用

通过钙成像技术，研究发现缺氧导致hiPSC-CMs钙处理功能严重紊乱。缺氧4小时和7小时后，异常钙瞬变比例显著上升（分别达52.6%和48.3%），异常类型包括不规则相位（Irregular Phase, IP）、双峰（Double Peaks, DP）、多峰（Multiple Peaks, MP）、上升延长（Prolonged Rise, PR）和高原异常（Plateau Abnormality, PA）。

左西孟旦和OR-1896处理显著降低了异常钙瞬变的发生率，4小时时分别降至15.8%和11%，7小时时为21.1%和10.8，与常氧对照组（约4%）无显著差异。钙瞬变参数分析显示，缺氧导致钙瞬变幅值（ΔF/F₀）下降，上升时间（rise time）和衰减时间（decay time）延长， beating频率（BPM）略有升高。药物处理组幅值得以恢复，上升和衰减时间部分缩短， beating频率则显著降低，甚至低于常氧组，提示其可能通过调节心率发挥抗心律失常作用。

缺氧对心肌标志物释放的影响及药物的调节作用

ELISA分析显示，缺氧24小时后，细胞培养基中cTnT和proBNP的释放显著增加，表明心肌细胞损伤和应激反应加剧。而左西孟旦和OR-1896处理显著降低了这两种标志物的水平，使其接近常氧对照组，提示药物能有效保护细胞膜完整性，减轻缺氧引起的细胞损伤。

缺氧对基因表达的影响及药物的调控作用

基因表达分析发现，缺氧导致多个功能类别基因表达显著上调。缺氧反应与HIF通路相关基因如ADM、HIF3A、HIG2、EDN1、HIF1A和EPAS1均上调；代谢适应基因如PRKAA2和MB表达增加；氧化应激基因（HMOX1、SOD3、MT3）、凋亡相关基因（PTEN、TP53）以及转录调控与信号基因（BHLHE40、NOTCH1、ING4、PIK3CA、TGFBR2）也明显上调。

左西孟旦和OR-1896处理则显著逆转了这些基因的表达变化，使其更接近常氧水平，表明药物能调控缺氧应答、氧化应激、凋亡和信号转导多条通路，从而增强细胞抵抗缺氧应激的能力。

讨论

本研究通过hiPSC-CMs缺氧模型，全面揭示了左西孟旦及其活性代谢物OR-1896在急性缺氧条件下的多重保护作用。这两种化合物不仅能显著减轻结构损伤、维持线粒体功能、降低损伤标志物释放，还能有效稳定钙处理、减少心律失常发生，并调控缺氧相关基因表达。

左西孟烷通过增敏肌钙蛋白C（cTnC）提高心肌收缩力，并通过开放血管平滑肌中的ATP敏感钾通道（K_ATP）诱发血管舒张，减轻心脏负荷。其代谢物OR-1896不仅表现出与母药相当甚至更强的保护效果，而且因其半衰期较长（70–80小时），有望在临床中提供更持久的治疗效果。

结论

本研究首次提供了OR-1896作为左西孟旦活性代谢物在抗缺血性心律失常和心肌保护方面的系统性证据。结果表明，左西孟旦和OR-1896通过多机制缓解缺氧引起的心肌细胞损伤和电生理紊乱，具有重要的治疗潜力。未来的研究应进一步探索其在更复杂模型（如3D培养、心脏类器官）及缺血再灌注情境下的效果，并推动其向临床转化。

研究局限与展望

本研究存在若干局限：hiPSC-CMs尚未完全成熟，也未区分心房、心室或起搏细胞亚型；实验在二维条件下进行，未能模拟三维心脏微环境；未考察长期缺氧或再灌注的影响；缺乏电生理（如膜片钳）和代谢（如Seahorse分析）的深入验证；药物为预防性给药，未模拟临床治疗后干预场景。今后需在这些方面进一步拓展，以全面评估药物的治疗潜力和机制。