靶向炎症的工程化益生菌EcNΔlpp::A5-aTN通过高效分泌抗TNF-α纳米抗体缓解溃疡性结肠炎

本文报道了一种基因工程改造的益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN），通过表面展示膜联蛋白A5（ANXA5）增强炎症靶向能力，并敲除lpp基因提升抗TNF-α纳米抗体（aTN）的分泌效率。该工程菌（EcNΔlpp::A5-aTN）在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中展现出优异的肠道定植能力，能有效缓解氧化应激介导的上皮细胞凋亡、修复黏膜屏障、改善免疫-微生物群平衡，其治疗效果优于野生型EcN和临床药物英利昔单抗（infliximab），为炎症性肠病（IBD）的精准治疗提供了新策略。

　　

1 引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病，益生菌大肠杆菌Nissle 1917（EcN）因其安全性和遗传可操作性被用于UC的早期治疗，但其临床疗效受限于较差的肠道定植能力。细胞凋亡过程中磷脂酰丝氨酸（PS）外化是UC进展的标志，膜联蛋白A5（ANXA5）能特异性结合PS，因此本研究通过基因工程改造EcN，使其表面展示ANXA5以增强靶向炎症部位的能力。同时，敲除分泌抑制基因lpp，提升蛋白分泌效率，并进一步构建能分泌抗TNF-α纳米抗体（aTN）的工程菌EcNΔlpp::A5-aTN，以克服传统抗TNF-α生物制剂如英利昔单抗的成本高、系统给药副作用大等局限。

2 结果

2.1 构建炎症靶向与分泌增强的EcNΔlpp::A5工程菌

研究证实，UC进程中凋亡的结肠上皮细胞PS暴露增加，静脉注射ANXA5-RFP蛋白显示其在结肠炎模型小鼠结肠中的积累显著高于十二指肠。利用基因工程技术，将ANXA5与OmpA跨膜域融合，表面展示于EcN，并敲除lpp基因以增强外膜通透性，成功构建EcNΔlpp::A5。Western blot、免疫荧光和流式细胞术验证了ANXA5在菌体表面的有效展示，且lpp缺失使异源蛋白分泌效率提升约15倍。工程菌的生长曲线、菌落形态和扫描电镜显示与野生型EcN无显著差异，表明遗传改造未影响细菌基本生理特性。

2.2 EcNΔlpp::A5定植能力增强

体外实验表明，EcNΔlpp::A5对凋亡CT26细胞的结合能力显著高于野生型EcN。通过LuxCDABE生物发光系统进行体内示踪，发现EcNΔlpp::A5在健康及结肠炎小鼠肠道中的定植均更强，且主要集中于大肠，心、肝、脾、肺、肾中无细菌 colonization。动态平板计数显示，EcNΔlpp::A5在120小时时仍保持较高定植水平，而野生型EcN几乎被清除。肠道冰冻切片荧光显微镜观察进一步证实了定植优势。

2.3 EcNΔlpp::A5-aTN的安全性评估

在EcNΔlpp::A5中转入表达aTN的质粒，构建EcNΔlpp::A5-aTN。该菌株生长曲线和菌落形态未发生改变，Western blot显示其aTN分泌效率显著高于EcN-aTN。ELISA测定发酵上清中aTN浓度可达1332.79±172.28 ng/mL。模拟胃液和胆盐环境中，工程菌存活率与野生型无差异。健康小鼠灌胃7天后，结肠长度、体重、器官形态和指数均无异常，血清ALT、AST、BUN、CREA等肝肾功能指标正常，H&E染色未发现心、肝、脾、肺、肾的组织病理损伤，证明口服安全性良好。

2.4 EcNΔlpp::A5-aTN显著缓解小鼠结肠炎

在DSS诱导的UC模型中，以英利昔单抗为阳性对照，EcNΔlpp::A5-aTN治疗组表现出最优的治疗效果：结肠长度缩短得到明显抑制，疾病活动指数（DAI）评分降低，体重恢复更快，粪便性状改善，肠道出血减少。组织学上，H&E染色显示结肠上皮排列整齐，隐窝结构完整；Ki67染色表明上皮增殖增强；阿尔新蓝染色证实黏液分泌增加。

2.5 抑制上皮氧化应激与凋亡

透射电镜（TEM）显示EcNΔlpp::A5-aTN能恢复紧密连接结构和绒毛形态。免疫荧光证实其对ZO-1和Occludin的修复作用强于EcNΔlpp::A5和英利昔单抗。DCFH-DA染色显示工程菌有效下调肠上皮细胞内活性氧（ROS）水平。TUNEL及免疫荧光检测cleaved caspase-3和cleaved caspase-8表明，EcNΔlpp::A5-aTN抑制细胞凋亡的效果最强。Western blot验证了其对caspase-8、caspase-3活化及JNK、p38磷酸化的抑制作用，表明工程菌通过抑制ROS/JNK/p38/Caspase-8/Caspase-3通路介导的凋亡缓解结肠炎。

2.6 调节肠道免疫微环境

qPCR显示EcNΔlpp::A5-aTN能更显著下调结肠IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17A的mRNA表达。免疫组化（IHC）表明其降低TNF-α和髓过氧化物酶（MPO）表达的效果最佳。流式细胞术分析肠固有层免疫细胞显示，工程菌减少CD11b⁺髓系细胞、F4/80⁺巨噬细胞、Ly6C⁺单核细胞和Ly6G⁺中性粒细胞浸润的效果最强，表明其能有效缓解炎症细胞聚集。

2.7 调节肠道菌群

16S rRNA测序显示，EcNΔlpp::A5-aTN处理显著增加拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度，促进Muribaculaceae和Lachnospiraceae等有益菌群的生长，降低变形菌门（Proteobacteria）中Sutterellaceae和Enterobacteriaceae等促炎菌群的 abundance。主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）表明工程菌能重塑肠道菌群结构。Alpha多样性指数（ACE、Chao1、observed species、Shannon）显示EcNΔlpp::A5-aTN最接近健康对照组，显著恢复菌群丰富度和多样性。线性判别分析（LEfSe）进一步确认了其促进有益菌、抑制有害菌的作用。

3 讨论

本研究成功构建了具有炎症靶向、高效分泌特性的工程菌EcNΔlpp::A5-aTN。其表面展示的ANXA5通过结合PS实现主动靶向，增强定植；lpp基因敲除大幅提升分泌效率；分泌的aTN局部中和TNF-α，有效阻断炎症 cascade。工程菌综合作用包括抑制上皮凋亡、修复屏障、调节免疫和菌群平衡，疗效优于传统EcN和英利昔单抗。该策略为IBD治疗提供了兼具靶向性、安全性和持续性的新型生物治疗平台，有望克服现有生物制剂系统给药的局限。未来需在克罗恩病模型及临床转化中进一步验证其应用潜力。