抗菌肽Citropin 1.3非酰胺化变体的淀粉样结构多样性与功能机制研究

本文系统研究了源自南钟蛙（Litoria citropa）的抗菌肽Citropin 1.3的非酰胺化变体（GLFDIIKKVASVIGGL-OH）的结构与功能特性。通过冷冻电镜（cryo-EM）、X射线晶体学和荧光显微镜技术，揭示了该肽在多种条件下自组装形成典型淀粉样纤维（amyloid fibrils）、多层纳米管（nanotubes）及新型混合纤维结构的现象。研究证实其在模型膜和细胞环境中诱导膜融合、液相分离（LLPS）及细胞死亡，并可与核酸共定位。这些发现深化了对淀粉样组装与抗菌机制关联的理解，为抗菌肽的功能多样性及结构可塑性提供了新视角。

　　

结构与环境依赖的聚集行为

通过冷冻电镜技术，研究团队发现Citropin 1.3在不同水溶液条件下呈现显著的结构多态性。当肽在50 mM NaCl（pH 5）中孵育时，形成典型的淀粉样纤维结构；而在10 mM PBS（pH 7.4）中则组装为宽纳米管；若在PBS中加入带负电荷的脂质体，则诱导产生三种不同的淀粉样纤维 polymorphs。这种环境依赖性聚集行为表明，肽的组装形态受离子强度、pH值及膜脂存在的显著影响。

高分辨率结构揭示的分子机制

在pH 5条件下形成的四种主要纤维形态（Pol I–IV）中，Pol II和Pol III的结构通过高分辨率冷冻电镜解析。Pol II呈现C3i对称性，每层由三条肽链构成 triskelion 状排列，其中Lys8与Leu16的羧基形成关键氢键，并存在类似LARKS（低复杂度芳香族扭结片段）的扭结构象。Pol III则显示C2对称性，每层含四条肽链，具有完全延展的β-sheet及链间静电相互作用。

尤为值得注意的是Pol I，其形成一种新型混合结构：外层由AlphaFold预测的α-螺旋阵列包裹，中层为倾斜52°的淀粉样β-sheet堆叠，内层结构未解析。这种同时包含α和β二级结构的组装形态在淀粉样研究中尚属首次报道。

晶体结构中的α-螺旋纳米管

X射线晶体学解析显示，Citropin 1.3在立方微晶中形成由α-螺旋二聚体螺旋排列组成的纳米管状超分子结构。该结构表面具有疏水与正电荷交替的带状区域，可能介导与负电荷脂质膜的相互作用。这一发现证实了该肽在非结晶环境中也存在形成螺旋组装体的倾向。

脂质膜诱导的纤维重构与膜融合效应

在脂质体存在下，Citropin 1.3的聚集偏好从纳米管转变为 cross-β 淀粉样纤维（Pol I-L至III-L）。其中Pol I-L与Pol II结构相似但缺乏扭结，而Pol II-L和III-L则呈现LARKS扭结及更显著的螺旋扭曲。

利用荧光标记的巨单层脂质体（GUVs）模型，研究观察到该肽可诱导膜融合而非经典裂解机制，并伴随肽-脂质液相分离（LLPS）液滴的形成。荧光恢复 after photobleaching（FRAP）实验证实这些液滴具有液体性质，表明环境中的大分子拥挤剂（如琼脂糖）可促进相分离发生。

真核细胞中的毒性机制与核酸相互作用

在人类肺上皮细胞（A-549）中，Citropin 1.3（LC₅₀ = 21 μM）迅速结合质膜，引起膜透化及细胞死亡。透化后肽积累于核仁，与核酸（PI染色）高度共定位（Pearson相关系数0.802），并在胞质中形成液滴状 condensates。FRAP再次证实其可诱导细胞内LLPS。该现象提示肽可能与核酸通过相分离相互作用，进而影响转录翻译过程，类似于某些核蛋白在神经退行性疾病中的行为。

原核细胞中的抗菌作用

针对革兰氏阳性菌 Bacillus subtilis（MIC = 8 μM），该肽通过膜透化机制导致细菌死亡，但胞内积累较少且与遗传物质共定位不显著。与真核细胞的差异可能源于膜表面电荷及胞内环境的不同：细菌膜富含负电荷，而癌变真核细胞外叶磷脂酰丝氨酸暴露增加，促进与阳离子肽的静电相互作用。

讨论：淀粉样组装与功能的多重关联

本研究揭示了Citropin 1.3前所未有的结构可塑性，其组装形态受环境因素（离子、pH、脂质、拥挤剂）调控。保守的 Lys–Leu16 静电相互作用及 Gly 残基介导的链柔性是关键结构基础。与 uperin 3.5 等肽的比较表明，不同AMP可能通过 distinct 组装路径实现功能调控：某些以淀粉样纤维直接作用，另一些则以动态组装过程介导膜扰动。

液相分离的发现进一步扩展了AMP的作用机制，提示其可能通过核酸 compaction 及相变抑制病原体基因表达。这种机制在真核细胞中的显著性或许与核仁的RNA-rich环境相关。

结论：结构多态性与生物功能的多维联系

非酰胺化Citropin 1.3通过其结构多态性（跨β纤维、纳米管、α-螺旋组装体）及环境响应性组装，展现了多重生物功能：膜融合、相分离、核酸相互作用及物种特异性毒性。这些发现不仅深化了对淀粉样抗菌肽机制的理解，也为针对膜与核酸的双靶点抗菌策略提供了新思路。