动情周期调节胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs）对食物摄入和体重的抑制效应：一项雌性大鼠模型的机制研究

本研究发现，雌性大鼠动情周期中的高雌激素阶段（Proestrus/Estrus, P/E）可显著增强GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）如利拉鲁肽（liraglutide）和司美格鲁肽（semaglutide）的食欲抑制和减重效果。研究揭示P/E期多个脑区Glp1r和Gcg基因表达上调，为女性肥胖治疗中个体化给药时机提供了重要理论依据。

　　

Abstract

Aims

新兴数据显示，针对胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的减肥药物在年轻女性中的处方量高于男性。然而临床前研究主要使用雄性动物来表征GLP-1R激动剂（GLP-1RAs）的减重机制，这凸显了对雌性特异性研究的迫切需求。近期研究发现，雌性大鼠的动情周期可能是GLP-1RA效应的调节因素。与雄性和其他阶段（动情后期和间期，M/D）相比，脑干Glp1r和GLP-1前体基因Gcg在动情前期和动情期（P/E）表达增加。基于此，研究者提出假设：GLP-1RAs的减重效果在P/E阶段可能增强。

Materials and Methods

通过独立实验，研究团队确定了在高脂饮食维持的雌性大鼠中，定时给予急性利拉鲁肽或慢性司美格鲁肽（分别在P/E或M/D阶段给药）是否会调节食物摄入和体重减轻。同时采用qPCR技术检测了与能量平衡控制相关的广泛分布核团中Glp1r表达的动情周期依赖性变化。

Results

与M/D阶段相比，在P/E阶段给予GLP-1RA增强了利拉鲁肽和司美格鲁肽的摄入抑制效果。此外，仅在P/E阶段给予司美格鲁肽比在M/D阶段给药导致更大的体重减轻。在多个核团中，P/E阶段的Glp1r表达也高于M/D阶段。

Conclusions

在P/E阶段给予GLP-1RAs可通过减少食物摄入导致显著更大的体重减轻。这些数据可能对跨月经周期的GLP-1RA给药时机具有转化意义。

1 INTRODUCTION

GLP-1R激动剂（GLP-1RAs）在治疗2型糖尿病和肥胖方面非常有效。由于减重效果显著，年轻女性现在是FDA批准的GLP-1RAs需求的主要推动力。临床文献指出，女性对GLP-1RAs的反应存在额外的性别特异性机制。与男性相比，女性对包括FDA批准的艾塞那肽、利拉鲁肽、司美格鲁肽和度拉糖肽在内的GLP-1RAs表现出更大的体重减轻百分比。然而，历史上大多数研究GLP-1R激动剂的临床前研究仅使用雄性动物模型，以避免与卵巢周期相关的厌食效应混淆。尽管如此，越来越多的数据指向GLP-1RAs的雌性特异性神经基础，并表明雌性大鼠对急性GLP-1RA可能表现出比雄性更高的敏感性。然而，卵巢周期本身对GLP-1RAs治疗效果的影响尚不清楚。

在两性中，GLP-1RAs通过抑制热量摄入促进体重减轻，通过激活中枢神经系统（CNS）中多个表达GLP-1R的神经群体实现。其中主要的CNS作用部位是孤束核（NTS），这是一个对能量平衡控制至关重要的后脑核团。NTS中的GLP-1R群体对于内源性GLP-1和外周给予的GLP-1RAs的厌食效应至关重要。尾侧NTS也是脑前胰高血糖素原神经元的主要来源，这些神经元合成内源性GLP-1并投射到许多与能量平衡控制相关的表达GLP-1R的核团。针对这些核团中许多核团的GLP-1Rs的靶向激活会导致食物摄入或食物动机的抑制。对于其中几个核团，有证据表明GLP-1R激活后存在性别差异行为。

众所周知，卵巢激素雌二醇负责卵巢周期内摄食的周期性抑制，在啮齿类动物中称为动情周期，在女性中称为月经周期。在啮齿类动物中，循环雌二醇水平在动情前期（P）达到峰值以促进排卵。雌二醇水平在随后的动情期（E）恢复到基线，但对食欲和摄入行为产生延迟效应，通常在E期减少食欲和摄入行为，通过对雌二醇反应基因的转录调控。动情周期和雌二醇抑制食物摄入的能力最好通过饱腹信号胆囊收缩素（CCK）的研究来表征。内源性CCK不仅是E期周期性摄食抑制的必要和充分条件，而且外源性雌二醇同样增强了CCK的饱腹效力和神经处理。虽然一些研究调查了GLP-1R作用与卵巢周期之间的相互作用，但多项研究表明外源性雌二醇增强了GLP-1RAs的厌食或抗渴效应。此外，最近研究发现脑干中GLP-1前体基因 glucagon (Gcg) 在P和E期表达增加，而Glp1r在E期表达更高。这种增加具有功能意义，因为脑干GLP-1R拮抗仅在组合的P和E（P/E）相比其他两个阶段（组合的动情后期（M）和间期（D）（M/D）恢复了预期的过度consumption。类似地，整个下丘脑的Glp1r在P晚期增加，并可能 underscore 外侧下丘脑GLP-1R激活在E期减弱食物强化能力，但在M/D期不能。

考虑到这些数据，研究者假设雌性在P/E可能表现出对GLP-1RAs的敏感性增加。P/E期内源性脑GLP-1或GLP-1R表达增加可能增强GLP-1RAs的效应。本研究通过调查大鼠动情周期调节两种美国FDA批准的GLP-1RAs、利拉鲁肽和司美格鲁肽的食物摄入和体重减轻效应的能力，以及通过表征分布核团中Glp1r表达的动情周期依赖性变化来探索这一假设。研究结果可能对跨月经周期的GLP-1R给药时机具有治疗转化意义。

2 MATERIALS AND METHODS

2.1 Animals

成年雌性Sprague–Dawley大鼠（Charles River）饲养在宾夕法尼亚大学的悬挂金属丝笼中，处于12:12小时黑暗：光照周期下，在温度和湿度控制的动物房中。所有动物自由饮水，并根据指定提供实验室 chow 饮食（Purina LabDiet）或高脂饮食（60% kcal 脂肪，Research Diets #D12492）。宾夕法尼亚大学机构动物护理和使用委员会批准了所有协议（803503）。

2.2 Estrous cycle tracking/vaginal cytology

使用每日阴道灌洗根据既定方案监测雌性动情周期。将每个阶段定义为从黑暗周期开始起的24小时。对于瘦肉动物，基于参考文献，在每个阶段结束时，光照周期开始后8小时收集样本。由于高脂饮食维持的雌性通常表现出动情阶段长度的更大变异性，调整了收集时间以更接近最佳（黑暗到光照过渡），对于高脂饮食维持的雌性，在光照开始前4-6小时收集样本。

2.3 Drug preparation

利拉鲁肽和司美格鲁肽从Cayman Chemical获得。将50 μg/kg的利拉鲁肽溶解在0.9%生理盐水中，并将20 nmol/kg的司美格鲁肽溶解在其载体[40 mM tris HCl缓冲液和0.01% Tween 20 (pH 8.0)]中，基于先前对食物摄入的影响。所有注射在黑暗周期开始前直接腹腔注射。

2.4 Liraglutide administration

为了模拟GLP-1RAs在人类中给药的条件，将雌性大鼠（n=30）维持在高脂饮食（HFD）上7周。到达时，动物平均266±1克，实验开始时为367±5克。在家庭笼测试前，使所有动物适应处理和腹腔注射。异食癖，即消耗非营养性高岭土粘土，是伴随GLP-1RAs的恶心/不适的充分记录行为。为了测量异食癖，在测试前使动物适应自由获取高岭土 pellets（K50001, Research Diets）至少5天。

在平衡的 within-subjects 设计中，在P/E（在P或E中一次）或M/D（在M或D中一次）对动物给予利拉鲁肽。这些阶段经常由于高雌激素水平（P）或效应（E）或低雌激素水平/影响（M和D）而被合并，因此将所有实验中的M/D和P/E动物合并。试图保持每个动物的注射阶段一致，以便在第一次P/E注射期间处于E的动物继续在E中注射，而不是P。在注射后1、3、6和24小时测量食物摄入，并在24小时后测定体重变化和高岭土摄入。每次治疗之间至少间隔72小时。n=3只动物因动情周期不一致而被排除。

2.5 Semaglutide administration

经过约2周的洗脱期后，在相同的高脂饮食维持的雌性队列（n=30）中研究了慢性给予长效合成GLP-1RA司美格鲁肽的影响。动物在实验开始时重383±6克。根据体重和动情周期长度（4-5天）将大鼠平衡到三个治疗组。所有组在P/E期间接受一次注射，在M/D期间接受一次注射，注射身份（载体或司美格鲁肽）因组而异。一组仅接受载体注射（n=8），一组在M/D期间接受司美格鲁肽注射，在P/E期间接受载体注射（n=10），第三组在P/E期间接受司美格鲁肽，在M/D期间接受载体（n=11）。试图保持每个动物的注射阶段一致。每次注射之间至少间隔48小时，司美格鲁肽注射每个周期发生一次，间隔至少96小时。有关示例时间线和进一步详情，请参见图S1。治疗进行了24天，每天记录食物和体重。对于每个司美格鲁肽治疗组，n=2只动物动情周期长度不一致，接受了5次而不是6次司美格鲁肽注射。由于动物在不同日期接受注射，为了比较时间点，基于4天动情周期每4天分析食物摄入。为了确定体重百分比变化，从起始体重中减去4天体重平均值。鉴于每只动物动情周期的变化，无法完全预测每个阶段，一些动物在接受司美格鲁肽注射时处于与其指定组不一致的阶段。一只动物在≥3/6的注射中在错误阶段注射被排除。

2.6 Tissue extraction for quantitative polymerase chain reaction (qPCR)

为了研究动情周期阶段对瘦肉动物中Glp1r表达的影响，使用了先前收集NTS/AP组织的chow维持雌性动物的皮层组织。为了检查动情周期阶段对高脂饮食维持动物中Glp1r和Gcg表达的影响，使用了上述利拉鲁肽和司美格鲁肽实验中的相同队列。载体治疗动物在脑提取前恢复10-11天。司美格鲁肽治疗动物恢复至少4周以与载体组体重匹配（根据每只动物最后一次司美格鲁肽注射的日子和平衡的牺牲日期，最多额外5天）。有关具体细节（图S2）和脑提取及qPCR方法，请参见支持信息附录。鉴于瘦肉和高脂饮食维持动物之间的时间和实验差异，未比较这些组。

2.7 Statistical analyses

使用GraphPad Prism 10.4.1（GraphPad Software）分析数据。使用配对t检验和重复测量或混合ANOVA分析行为数据，然后进行Holm-?ídák事后检验。基因表达数据使用配对t检验分析。具体测试和结果，包括主效应和交互作用，呈现在表S2中。认为p<0.05显著，并在图注中表示相关事后的显著性。所有数据表示为平均值±SEM。

3 RESULTS

3.1 Glp1r expression across the estrous cycle in lean animals

先前研究表明，与M/D相比，NTS/AP中的Glp1r和Gcg表达在P/E增加。使用这些相同瘦肉雌性大鼠的存档新鲜冷冻脑，确定了动情周期是否影响选定神经核团中的Glp1r表达（图1）。根据文献显示这些核团中GLP-1Rs激活减少摄入行为选择了每个区域，包括NAc、BNST、PVN、PVT、CeA、Arc和VTA。与M/D的表达水平相比，发现在P/E的动物中NAc（图1A）和BNST（图1B）的Glp1r表达增加（均p<0.005），但PVN（图1C）没有。P/E期间的Glp1r表达在PVT（图1D）、CeA（图1E）、Arc（图1F）和VTA（图1G）也增加（均p<0.05）。鉴于这些动情周期依赖性变化，接下来调查了与Glp1r增加相关的动情阶段是否会增强两种GLP-1RAs的厌食效应。

3.2 Liraglutide administration

首先调查了动情阶段是否会调节高脂饮食维持的雌性大鼠中急性给予利拉鲁肽（50 μg/kg）的厌食、减重效应（图2）。利拉鲁肽具有主效应，在3、6和24小时后分别显著减少累积食物摄入1.29±0.24、2.65±0.32和7.68±0.40克。也有动情周期阶段的影响，P/E的大鼠在所有时间点消耗少于M/D的动物（1小时：0.78±0.20克，24小时：3.36±0.35克更少）。在24小时，动情阶段和利拉鲁肽之间存在显著交互作用（图2A）。P/E中利拉鲁肽治疗的动物消耗少于（p<0.0001）P/E中载体治疗的动物（减少6.91±0.34克）和M/D中利拉鲁肽治疗的动物（减少2.56±0.34克）。此外，在24小时，P/E中的动物显示从其各自载体治疗的累积食物摄入百分比抑制显著更大（P/E：65.1% vs. M/D中的57.57%）（图2B）。相反，利拉鲁肽和动情周期对体重有单独的主效应（均p<0.0001），没有交互作用（图2C）。利拉鲁肽注射的动物比载体注射的动物损失更大的体重百分比（3.67±0.16%），并且P/E中的动物比M/D中的动物损失更多体重（1.70±0.11%）。这些单独的加性效应导致P/E中利拉鲁肽治疗的动物在注射后损失最大百分比的体重。然而，相对于其各自的载体治疗，M/D和P/E中利拉鲁肽治疗的动物显示出相似程度的体重减轻（M/D：3.48% vs. P/E：3.86%；p=0.069）（图2D）。最后，利拉鲁肽治疗，但不是动情周期，引发了异食癖反应（即高岭土摄入）（图2E）。利拉鲁肽给药增加了24小时高岭土摄入 compared to载体治疗的动物1.00±0.11克（p<0.0001）。

3.3 Semaglutide administration

为了模拟GLP-1R基于治疗的慢性使用，接下来进行了24天的 between-subjects 研究，使用司美格鲁肽。图3描述了在P/E或M/D期间一致给药对司美格鲁肽的摄入抑制和体重减轻效应的影响。相对于载体治疗的动物，在M/D或P/E期间给予司美格鲁肽显著减弱了累积（图3A）和4天分箱非累积食物摄入（图3B）（4、8、12、16、20、24）时间点（p<0.05）。最大累积食物摄入抑制发生在24天后；M/D中的动物消耗减少96.0±9.12克，P/E中的动物消耗减少125.70±8.94克（均p<0.0001）比载体治疗的动物。与M/D期间的注射相比，P/E期间的注射导致在第8、12、16、20和24天累积食物摄入的更大抑制（均p<0.05），在24天后累积摄入量最大差异，当P/E注射相对于M/D给药的司美格鲁肽减少摄入29.68±8.41克（p=0.0016）。相反，P/E期间的注射导致在第8、12和24天结束的分箱中非累积食物摄入的更大抑制（均p<0.05），第20天分箱有趋势（p=0.0604），第16天分箱非累积摄入无差异。

司美格鲁肽在P/E或M/D期间给药 produced a significant reduction in body weight percentage（图3C）与载体治疗的大鼠相比，在所有时间点除了第8天。在第8天，P/E中注射司美格鲁肽的大鼠（p<0.0001），但不是M/D（p=0.0573），显示出显著减少。24天后，载体治疗的动物增加了4.95±0.57%，M/D司美格鲁肽治疗的动物损失了7.89±1.06%，P/E司美格鲁肽治疗的动物损失了12.15±1.55%。在P/E期间给予司美格鲁肽 also produced a greater percentage of body weight loss compared to injections during M/D at days 8, 12, 16, 20, and 24（均p<0.05）。到24天，P/E中注射司美格鲁肽治疗的动物比M/D中司美格鲁肽治疗的动物多损失了4.25±1.38%（p=0.007）。

3.4 Glp1r and Gcg expression across the estrous cycle in high-fat diet-maintained animals

接下来评估了在同一高脂饮食维持的雌性大鼠中，Glp1r和Gcg表达水平是否在动情周期中不同。在NTS/AP内，Gcg（p<0.0001）（图4A）和Glp1r（p=0.0286）（图4B）在P/E期间比M/D动物更大。

图5描述了动情周期对相同动物皮层中选定核团Glp1r表达的影响。与M/D的表达水平相比，P/E中的动物显示NAc（图5A）和BNST（图5B）中Glp1r表达增加（均p<0.001），但PVN（图5C）或PVT（图5D）没有。P/E Glp1r表达在CeA（图5E）、Arc（图5F）和VTA（图5G）更大（均p<0.05）。

4 DISCUSSION

新兴数据显示，大多数处方GLP-1RAs的年轻成年人是女性，这强调了临床前GLP-1研究中的知识差距，这些研究不一致地包括雌性。本研究通过评估动情周期对两种不同美国FDA批准的抗肥胖药物摄入和体重减轻效应的影响来解决这一问题。重要的是，数据并未显示内源性GLP-1的变化在介导动情周期中周期性厌食行为中起直接作用。相反，研究表明，与M/D相比，在P/E定时给予GLP-1RA增强了利拉鲁肽的累积摄入抑制效应。虽然慢性司美格鲁肽在P/E给药并未在所有4天分箱中 consistently produce a reduction in noncumulative intake compared to M/D administration，但令人鼓舞的是，减少在最后一个时间分箱中持续。此外，P/E中的司美格鲁肽注射 compared to semaglutide administration in M/D produced a greater suppression of cumulative food intake，导致在慢性司美格鲁肽注射12天后开始显著更大的体重减轻。还强调了一个可能的机制。在瘦肉和高脂饮食维持的雌性大鼠的多个核团中，P/E期间Glp1r表达增加。迄今为止，这是第一项显示慢性司美格鲁肽在P/E给药可以增加体重减轻相对于M/D给药在大鼠中的研究。

食物摄入数据特别值得注意，因为能量消耗在P/E增加，并部分解释了动情周期中体重的变化。数据指向增强的GLP-1RA食物摄入抑制作为导致P/E更大（无论是加性还是协同）体重减轻的一个因素。除了食物摄入之外调节体重的因素可能解释了急性利拉鲁肽实验中体重上缺乏交互作用。虽然P/E期间的利拉鲁肽给药交互以增强食物摄入抑制，但利拉鲁肽和动情周期独立影响体重。这些单独效应 together still produced the greatest body weight loss in liraglutide-treated animals in P/E。鉴于利拉鲁肽和P/E的小交互作用，可能需要慢性GLP-1RA给药来观察增强的体重减轻。然而，很明显，P/E期间的慢性司美格鲁肽给药导致比M/D司美格鲁肽给药更大的体重减轻。无论机制如何（加性 vs. 协同），这些发现，如果可转化，对动情周期和GLP-1RAs之间的关系具有有意义的影响。

药理学研究表明，P中达到峰值的雌二醇调节控制食物摄入的中枢机制，以产生主要在E发生的厌食效应，当雌二醇水平已恢复到基线。推测P中的雌二醇同样 provoke the Glp1r and Gcg increase that contributes to greater P/E GLP-1RA effects。确实，先前研究表明雄性中雌二醇给药增加了NTS/AP Glp1r and Gcg to levels resembling females in P/E。随着循环雌二醇水平在绝经后下降，这强调了在绝经后雌性中进行GLP-1研究的需要。鉴于雌二醇峰值到行为效应 onset 的时间差异，将P/E合并的研究限制了确定动情周期哪个阶段增强GLP-1RA摄入抑制效应或增加Glp1r compared to M/D的能力。值得注意的是，CCK的饱腹能力在E specifically enhanced（相对于D），并且先前在瘦肉动物中的数据 showed increased NTS/AP Glp1r expression in E, but not P。因此，行为效应可能主要发生在E。然而，还发现P和E中NTS/AP Gcg表达增加，这假设可能增强GLP-1RA敏感性。最后，雌二醇影响基因表达的速度/机制变化可能 underscore 不同饱腹信号的动情周期依赖性效应。

虽然急性利拉鲁肽产生了预期的高岭土行为增加，但未观察到任何动情周期依赖性对高岭土摄入的影响。这些数据可能表明，相对于M/D，P/E给药可以增强利拉鲁肽的摄入抑制效应，而不会引发更大的恶心/不适。尽管如此，女性表现出比男性更频繁的恶心和呕吐，即使在相似的司美格鲁肽暴露水平。据报道，P/E中的大鼠更可能将高岭土拆成小块。虽然动物在E期间表现出增加的体力活动，但这种混淆可能增加了误差，未来研究可能受益于跨动情周期跟踪GLP-1R诱导不适的额外方法。

在瘦肉和高脂饮食维持的动物中，表明P/E期间Glp1r表达在NAc、BNST、CeA、Arc和VTA增加。此外，高脂饮食维持的雌性大鼠 also increased NTS/AP Gcg and Glp1r during P/E，与先前数据一致。当与行为数据一起考虑时，然而，可能上述核团中增加的Glp1r介导了P/E中GLP-1RAs摄入抑制效应的增强相对于M/D。背迷走复合体内的GLP-1R表达细胞，包含NTS和AP，对于基于GLP-1的肥胖药物的减重效应是必要的。此外，荧光标记的司美格鲁肽和利拉鲁肽到达并 provoke increased neuronal activity in the Arc, PVN, NTS/AP, and increase neuronal activity in the BNST and CeA。值得注意的是，外源性雌二醇影响下丘脑中Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (Gapdh)表达，并可能其他脑区域。尽管动情周期中雌二醇对Gapdh的影响未知，但使用Gapdh作为看家基因需要谨慎解释基因表达数据。

GLP-1RAs的减重益处似乎在更年轻和女性的患者中最有效。生理因素，包括体脂分布差异和女性更大的脂肪量， nor 药代动力学差异，完全解释了这些体重减轻功效的性别差异。然而，这些差异的根源 otherwise unclear。这里，观察到Glp1r和Gcg的动情周期依赖性变化可能解释其中一些差异。确实，先前研究表明NTS/AP Glp1r and Gcg is increased during P/E relative to male levels。考虑到这种方向性，增加的Glp1r and Gcg expression could enhance GLP-1RA effects compared to males。数据不仅强调了肥胖管理中性别特异性考虑的必要性，而且表明应注意绝经前或绝经后状态。

这里呈现的数据表明，在组合的P和E期间给予GLP-1RA可以增强GLP-1RAs的摄入抑制效应相对于M/D给药，可能导致增加的体重减轻。如果这些发现在临床文献中复制，那么处方医生在治疗女性时可能需要考虑月经周期阶段。