牙龈与舌鳞状细胞癌基因表达及甲基化谱差异揭示部位特异性分子机制与免疫微环境特征

本综述系统比较了牙龈鳞癌（GSCC）与舌鳞癌（TSCC）的转录组、表观基因组及肿瘤免疫微环境差异，揭示HOX基因家族（如HOXC13/HOXD11）异常表达与3′ UTR甲基化调控的关联，证实解剖部位特异性分子通路（细胞周期/抗菌免疫通路激活于GSCC，免疫应答通路富集于TSCC）及免疫细胞浸润模式的显著差异，为口腔鳞癌（OSCC）的精准分型与靶向治疗提供关键理论依据。

　　

ABSTRACT

本研究针对口腔鳞状细胞癌（OSCC）中预后较差的牙龈鳞癌（GSCC）和常见舌鳞癌（TSCC）开展多组学分析，旨在阐明部位特异性的基因表达变化机制及肿瘤免疫特征。基因表达分析显示GSCC中细胞周期和抗菌体液免疫通路显著上调，而TSCC中免疫应答通路更为活跃。HOXC13高表达可能与GSCC预后相关。DNA甲基化分析发现HOXD11基因3′ UTR区超甲基化促进其表达。肿瘤免疫分析揭示GSCC肿瘤组织中免疫细胞数量无显著变化但CD8⁺ T细胞等炎症细胞比例改变，TSCC则呈现T淋巴细胞数量与比例双重上升。这些发现强调了基于解剖部位制定OSCC个体化治疗策略的重要性。

1 Introduction

OSCC作为头颈鳞癌（HNSCC）的重要亚型，全球年新增病例约35万且死亡率居高不下。尽管靶向药物和免疫检查点抑制剂已有应用，疗效仍受限，亟需探索新型生物标志物和治疗策略。癌症细胞异质性和肿瘤微环境构成差异被认为是疗效差异的重要原因。既往研究提示OSCC不同亚型预后显著不同，其中硬腭OSCC和GSCC预后最差，而磨牙区GSCC和TSCC复发率最高。TCGA等基因组研究多聚焦TSCC，对GSCC等非舌部OSCC的全面基因组分析仍较缺乏。表观遗传改变在癌变早期即可发生，且受酒精、吸烟、饮食及口腔细菌引发的牙周炎等因素调控，可能进一步影响免疫系统。本研究首次对GSCC和TSCC进行转录组、表观基因组和肿瘤免疫学的综合对比分析，以揭示部位特异性的分子特征。

2 Materials and Methods

本研究经大阪大学伦理委员会批准（编号768937），纳入2018–2022年手术的31例GSCC和27例TSCC患者肿瘤及正常组织样本。使用AllPrep DNA/RNA Mini Kit提取核酸，NanoDrop和Qubit进行质控。转录组测序采用Illumina Stranded Total RNA Prep建库，NovaSeq6000测序，edgeR包进行差异表达分析（|logFC|>1且p<0.05）。富集分析通过Metascape完成。DNA甲基化检测使用Infinium MethylationEPIC芯片，ChAMP流程进行标准化和差异甲基化区域（DMR）分析。肿瘤免疫细胞浸润通过CIBERSORTx计算22种免疫细胞比例，免疫谱分析采用ssGSEA算法。统计使用R语言和Excel，生存分析采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。

3 Results

3.1 Study Population

GSCC患者中位年龄显著高于TSCC（77 vs. 66岁，p=0.0004），女性更多见且饮酒史较少（p=0.0076）。GSCC中T4期肿瘤比例更高（p=0.0226），但淋巴结转移无显著差异。早期病例中TSCC预后较GSCC更差，晚期病例预后相似。淋巴结转移状态不影响二者预后差异。

3.2 Gene Expression Analyses Across GSCC and TSCC

热图分析显示HOX和MMP基因簇在肿瘤组织中表达变化显著。HOXC11等基因在牙龈和舌肿瘤中均上调，但表达模式存在部位差异。基于肿瘤/正常表达比的高变异基因聚类显示GSCC与TSCC形成独立簇群，证实需分别分析。

3.3 Gene Expression Analyses Between Each Normal and Cancer Sample

正常组织比较中，牙龈高表达PIGR、IRX1、MUC5B等基因，富集于免疫炎症和细菌应答通路；舌组织高表达SBK2、HOXA3、LRRC24，富集于肌肉结构通路。肿瘤组织中，GSCC上调FDCSP、MIA、RPL36A并富集中性粒细胞脱颗粒通路；TSCC上调ACTA1、MYH2、COX6A2且肌肉发育通路持续活跃。肿瘤/正常比值分析显示GSCC中MAGEA3、MAGEA4、MMP1高表达且细胞周期通路上调；TSCC中CST1、MAGEA3、MAGEA6高表达且免疫激活通路富集。

3.4 Gene Expression Analysis by Sublocations for Gingival and Tongue Cancer

GSCC中高变异基因聚类无显著分组，预后无差异；TSCC聚为两簇（簇1/2），簇2（复发/转移组）预后较差（p=0.055）。TSCC非复发组中CXCL家族和免疫基因显著上调，富集获得性免疫和炎症应答通路。免疫谱显示复发组呈"冷肿瘤"特征，非复发组呈"热肿瘤"特征。

3.5 Comparison of Sublocations of GSCC and TSCC

GSCC与TSCC比较中，TSCC免疫基因表达更高且免疫应答通路富集；GSCC中IL1A表达显著升高，抗菌肽基因（DEFB103A/DEFB4A）和细胞周期通路激活，HOXC13/HOXA6等HOX基因上调。HOXC13表达比值（肿瘤/正常）≥7.0的GSCC患者无病生存期显著缩短（p=0.033）。

3.6 DNA Methylation Array Analysis

启动子区甲基化多数抑制基因表达，但部分HOX基因启动子甲基化后表达反而上调。HOXD11在GSCC和TSCC中均因3′ UTR超甲基化而表达增加，且甲基化水平与表达量呈弱相关。

3.7 Immune Cell Infiltration Analysis

正常组织比较中，牙龈免疫细胞数量总体高于舌部。GSCC肿瘤与正常组织比较中免疫细胞总数无变化但CD8⁺ T细胞等比例改变，活化树突细胞、嗜酸性粒细胞等8种细胞数量增加而 na?ve B细胞等3种减少。TSCC肿瘤中T淋巴细胞等炎症细胞数量与比例均上升，Treg、M0/M1巨噬细胞等11种细胞增加而嗜酸性粒细胞和单核细胞减少。免疫细胞数量与预后无显著关联。

4 Discussion

本研究揭示GSCC和TSCC在分子通路、表观调控和免疫微环境方面存在显著差异：GSCC以细胞周期通路上调和抗菌免疫应答为特征，IL1A和HOXC13作为关键分子可能影响预后；TSCC则以免疫应答激活为主。HOXD11通过3′ UTR甲基化机制在两种癌型中均上调表达。免疫微环境方面，GSCC呈现免疫细胞比例重构而TSCC则整体数量增加。与传统认知不同，本研究发现在早期病例中TSCC预后反而更差，可能与解剖结构、细菌暴露及机械刺激差异相关。HOX基因在癌变中的双重作用及3′ UTR甲基化促表达机制为OSCC表观调控研究提供新方向。研究局限性包括样本量、随访时间及正常组织取样范围，未来需扩大样本并对比远癌正常组织以全面评估表观遗传改变。本研究强调OSCC应依据解剖部位进行分子分型，为个体化治疗策略制定奠定基础。