基于环境DNA（eDNA）技术监测鲑鱼肾增生病病原体：环境参数的影响与监测策略优化

本综述系统评估了利用环境DNA（eDNA）技术非侵入性监测鲑鱼肾增生病（PKD）病原体Tetracapsuloides bryosalmonae的可行性及其关键影响因素。研究通过全年采样与微滴式数字PCR（ddPCR）技术，证实水温与空气温度显著影响eDNA检出率，并提出以空气温度作为水温替代指标的新策略。同时，研究明确了降水事件对滤膜堵塞及检测成功率的负面影响，为未来eDNA监测方案的优化提供了重要科学依据。

　　

引言

鲑鱼肾增生病（Proliferative Kidney Disease, PKD）是由Tetracapsuloides bryosalmonae引起的一种严重危害鲑科鱼类的传染性疾病，在北美和欧洲多个地区均有流行，尤其在瑞士导致野生褐鳟种群数量显著下降。该病目前被列为瑞士法定报告疾病，传统监测方法依赖于有创采样和幼鱼牺牲，不仅操作复杂、成本高昂，还可能对鱼类资源造成进一步压力。

近年来，环境DNA（environmental DNA, eDNA）技术作为一种非侵入性、高灵敏度的生物监测工具，被广泛用于水生病原体的检测与监测。该技术通过捕获水体中脱落的DNA，实现对目标物种或病原体的存在判定。已有多个研究团队建立了针对T. bryosalmonae的eDNA检测方法，并证实其可行性。然而，环境因素如温度、降水、季节变化等对eDNA检测成功率的影响仍不明确，限制了该技术在实际监测中的推广应用。

T. bryosalmonae的生活史涉及两个宿主：淡水苔藓虫（如Fredericella sultana）作为终宿主，释放出的苔藓虫孢子（bryozoan malacospores）可感染鲑科鱼类；受感染的鱼则释放出鱼源孢子（fish malacospores），完成传播循环。孢子释放与发育过程高度依赖水温，实验室研究表明，在14°C时孢子释放持续时间最长，而在较高温度下（如15–20°C）孢子释放更早开始但持续时间缩短。鱼类排泄孢子的能力也在12–15°C之间最为显著。

基于上述背景，本研究旨在系统评估影响T. bryosalmonae eDNA检测的关键环境参数，明确最佳采样季节与条件，并提出科学可靠的监测建议。

材料与方法

eDNA样本采集与处理

自2021年4月至2022年4月，研究团队在瑞士六条已知T. bryosalmonae阳性的河流中进行了25次采样，平均每两周一次。每次采样收集4个600 mL水样，使用0.45 μm孔径的Sterivex滤膜（Merck Millipore）进行过滤，并同步设置阴性对照。若因水体浑浊导致滤膜堵塞，则记录实际过滤体积。

滤膜在运输过程中保存于冰上，之后在?20°C条件下存储直至DNA提取。提取使用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN）完成，提取后的DNA浓度与质量经Qubit Flex Fluorometer（Thermo Fisher Scientific）检测，并于?20°C保存以待后续分析。

微滴数字PCR（ddPCR）检测

采用先前建立的ddPCR方法，以Bettge等人发表的引物与探针体系靶向T. bryosalmonae小亚基18S rRNA基因序列。每个反应体系包括Bio-Rad ddPCR supermix、引物、探针及4 μL模板DNA，总反应体积20 μL。使用QX200系统（Bio-Rad）生成微滴，PCR扩增程序包括95°C 10分钟预变性，随后94°C 30秒、60°C 1分钟，共45个循环，最后98°C 10分钟灭活。微滴读取与拷贝数计算通过QuantaSoft软件完成。每个样本设3个技术重复，阳性判定阈值为3500 RFU，检出限（LOD）设定为6.6 copies/反应。

其他环境参数的获取与分析

在研究期间，于六个时间点对每条河流的苔藓虫进行了采样与物种鉴定，并通过qPCR检测其感染状况。水温数据通过HOBO温度记录仪每15分钟自动记录一次，计算日平均与双周平均水温。气温和降水数据则取自瑞士气象局（MeteoSwiss）最近的气象站，分类统计不同时间尺度下的累积降水量。

数据处理与多尺度占用模型

采用多尺度占用模型（multi-scale occupancy modeling）评估eDNA检测概率，该模型包含三个层次：采样点存在概率、滤膜捕获概率以及ddPCR技术检测概率。模型纳入气温、降水量、采样点等变量，通过Watanabe–Akaike信息准则（WAIC）进行模型选择，并以95%置信区间（CrI）报告后验概率中位数。

结果

eDNA检测与季节模式

在所有六条河流中均检测到T. bryosalmonae的eDNA。全年600个野外重复样本中，96个（16%）在至少一个技术重复中显示阳性信号高于LOD，另有75个（12.5%）为低于LOD的阳性，总阳性率为28.5%。阳性样本绝大多数出现在4月中旬至10月底之间，仅一例于3月下旬检测到高于LOD的信号。阴性对照中除一例极低信号外，均未出现扩增。

苔藓虫存在与感染状况

在5条河流中检出Fredericella sultana，其中8份样本（47.1%）呈T. bryosalmonae阳性，全部集中于5月底至10月底。eDNA检测结果与苔藓虫感染状况的一致性仅为58.8%，存在一定程度的差异。

水温与气温的影响

日平均水温范围在5.6–19.4°C之间。98.3%的eDNA阳性样本在日平均水温高于8°C时采集到，71.9%的阳性样本在水温高于14°C时获得。气温与水温呈高度相关（Pearson相关系数0.908–0.952），模型中气温较水温更具预测力。

降水对检测的影响

降水并未显著降低eDNA检出率，阳性率在无雨日与有雨日分别为29.0%与27.8%。然而，较高的降水量（尤其是10–50 mm）易导致滤膜堵塞，39个样本未能完成600 mL过滤，其中仅10.3%检出阳性，显著影响检测成功率。

多尺度占用模型验证

最优模型显示，气温对采样点存在概率具有显著正向影响（系数中位数0.29，95% CrI: 0.17–0.45），而降水量对各级别概率的影响均不显著，但其通过减少过滤体积间接降低了检测成功率。

讨论

本研究首次系统评估了环境参数对T. bryosalmonae eDNA检测的影响，证实水温是影响检测成功率的最关键因素，8°C以上方可实现稳定检出，14°C以上时检出率显著提高。这一结果与孢子释放的温度依赖性高度吻合，也印证了Gay等人提出的“8°C感染阈值”。

气温可作为水温的良好替代指标，其数据更易获取且与水温变化趋势一致，但需注意气象站位置与实地条件可能存在差异。降水虽不直接削弱eDNA信号，但通过增加水体浊度、导致滤膜堵塞，间接限制了检测体积，从而影响检出概率。

eDNA与苔藓虫检测结果之间的不一致可能源于多种因素：苔藓虫感染的斑块分布、孢子释放的间歇性、eDNA在水体中的传输与衰减特性等。此外，eDNA可能来自鱼类释放的孢子或其降解产物，这增加了结果解读的复杂性。

总结与建议

基于全年采样与模型分析，本研究为未来eDNA监测提出以下建议：

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  采样应优先选择水温高于14°C的时段，通常为春末至初秋；
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  可使用气温数据辅助决策，但需确保数据来源可靠且与实地条件匹配；
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  应避开强降水后的数日，以降低滤膜堵塞风险，保证足够过滤体积；
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  建议开展多年份、多河流的验证研究，以进一步优化监测策略。

T. bryosalmonae的eDNA监测技术具备显著的应用潜力，可在不影响鱼类种群的前提下实现高效、灵敏的病原监测，为渔业管理及疾病防控提供重要技术支持。