靶向鳗鲡逆转录转座子UnaSINE1显著提升环境DNA（eDNA）检测灵敏度与定量准确性研究

本研究创新性地利用鳗鲡特异性逆转录转座子序列UnaSINE1开发高灵敏度环境DNA（eDNA）检测方法，突破传统线粒体标记（mtDNA）在低生物量环境中的检测瓶颈。实验证明该标记在基因组与eDNA样本中拷贝数超线粒体标记100倍以上，野外调查将阳性样本检出率从32/81提升至62/81，显著降低假阴性率并提升定量稳定性，为濒危物种监测提供重要技术支撑。

　　

ABSTRACT

环境DNA（eDNA）分析在目标物种密度低或eDNA释放量少的季节面临灵敏度与定量准确性的挑战。本研究以鳗鲡特异性短散在核元件（SINE）家族UnaSINE1为靶标，开发新型eDNA检测方法，并与线粒体16S rRNA标记进行对比。结果显示，UnaSINE1在基因组和eDNA样本中的拷贝数均超过线粒体标记100倍以上。河流调查中，16S标记阳性样本为32/81，而UnaSINE1标记达62/81，显著降低假阴性。技术重复与生物学重复均显示更高的检测一致性和更低的定量变异，为eDNA研究提供强效工具。

1 Introduction

生物多样性快速丧失凸显生物监测的重要性。传统监测依赖物理捕获与视觉调查，而eDNA分析通过检测环境中残留的DNA片段，具备非侵入性、大范围物种探测等优势。但该方法存在假阴性风险，尤其在种群密度极低或eDNA释放量少的条件下。既往通过增加水样体积、优化DNA纯化或使用数字PCR等策略提升灵敏度，但伴随成本与工作量增加。多拷贝标记如线粒体基因组DNA与核糖体DNA（rDNA）虽广泛应用，但其细胞拷贝数仍限制检测灵敏度。逆转录转座子作为基因组中高丰度移动遗传元件，拷贝数远超线粒体标记，如人类基因组中SINE拷贝达150万。本研究以鳗鲡属特异性UnaSINE1为靶标，开发eDNA检测新方法，旨在提升检测灵敏度与准确性。

2 Materials and Methods

2.1 Assay Development

从NCBI数据库获取UnaSINE1序列，以UnaSINE1-8（AB179628.1）为查询序列进行BLAST比对，针对鳗鲡目物种筛选长度>200 bp的序列。手动设计引物靶向保守核心区，扩增子大小80–200 bp，退火温度约60°C，引入简并碱基兼容序列变异。

2.2 Specificity Test

通过Primer-BLAST进行^{in silico}特异性验证，并使用鳗鲡属（A. japonica、A. marmorata）与非鳗鲡物种（如Conger myriaster）基因组DNA进行^{in vitro}测试。实时定量PCR（qPCR）采用TaqMan探针法，模板浓度为10 pg/反应。

2.3 Sensitivity Test

系列稀释A. japonica基因组DNA（10^?4–10¹ pg/反应）比较标记丰度。以标准DNA稀释系列评估检测限（LOD）与定量限（LOQ），使用R包“ednar”计算检测概率≥95%的LOD与CV<35%的LOQ。

2.4 Field Survey

于2023年2月、6月、10月在日本兵库县9个淡水点采集水样（500 mL×3生物学重复），添加苯扎氯铵（BAC）防腐。过滤后提取DNA，使用QuantStudio 3.0平台进行qPCR，以合成DNA标准品定量。通过Sanger测序验证新增阳性样本。

2.5 Statistical Analysis

使用R 4.4.2进行线性混合模型（LMM）分析eDNA浓度相关性，McNemar检验比较检测频率，Wilcoxon检验分析变异系数（CV）差异。

3 Results

UnaSINE1 assay成功扩增所有鳗鲡物种，非鳗鲡物种无扩增。灵敏度测试显示SINE标记检测所需gDNA浓度比线粒体标记低两个数量级（0.001 pg vs 0.1 pg），拷贝数高263倍。尽管SINE assay的LOD（31.1 copies/反应）与LOQ（122 copies）高于线粒体标记（6.9 copies与9 copies），但其高拷贝数保障了检测优势。野外调查证实SINE标记平均eDNA浓度（17,458.6 copies/L）为线粒体标记（102.2 copies/L）的170倍，且浓度显著相关（R=0.931）。SINE标记在21个采样点检出eDNA，线粒体标记仅14个点，新增阳性点经测序确认为鳗鲡来源。技术重复与生物学重复的CV值均显著低于线粒体标记。

4 Discussion

本研究首次实现水体中逆转录转座子检测，显著提升eDNA分析灵敏度。SINE标记通过高拷贝数特性有效克服低生物量环境中的假阴性问题，尤其适用于冬季等eDNA释放量低的季节。空间分析显示eDNA浓度下游高于上游，与鳗鲡栖息偏好一致，而线粒体标记未能呈现显著梯度。该方法不增加采样与实验成本，但需注意SINE标记可能限于属水平鉴定，且开发依赖基因组数据。随着基因组数据库扩展，核重复序列作为eDNA标记的应用前景广阔。