Ptgs2+ CPTCs通过响应针刺机械刺激并介导Il6–Il6st–Stat3通路激活M2巨噬细胞以建立“力-免疫轴”抗炎机制

本研究发现大鼠腹部中线筋膜（AMF）中的Ptgs2+ CPTCs（Cd34+/Pdgfra+ Telocytes亚群）可响应针刺机械刺激，并通过Il6–Il6st–Stat3通路激活M2巨噬细胞分泌Il10发挥抗炎作用。该研究首次揭示了“力-免疫轴”的细胞机制，为针灸抗炎作用的物质基础提供了重要证据，对免疫相关疾病的治疗具有潜在转化价值。

　　

ABSTRACT

近期研究强调了开展筋膜组织细胞学探索的必要性。特络细胞（Telocytes, TCs）作为结缔组织中的特殊间质细胞已引起广泛关注。本研究通过单细胞测序和细胞形态学分析，揭示了大鼠腹部中线筋膜（Abdominal Midline Fascia, AMF）中以Cd34⁺/Pdgfra⁺ 特络细胞（CPTCs）为主要细胞类型。通过深度学习鉴定出六个CPTC亚群，其中Ptgs2⁺ CPTCs对机械刺激表现出显著响应性。在细菌性痢疾大鼠模型中对AMF特定穴位（CV4、CV6、CV12）进行针刺刺激后，Ptgs2⁺ CPTCs比例显著增加，且与所有CPTC亚群的细胞粘附作用增强。重要的是，Ptgs2⁺ CPTCs通过Il6–Il6st–Stat3通路激活M2巨噬细胞，促进抗炎反应。本研究首次确立了Ptgs2⁺ CPTCs作为连接机械刺激与免疫调控的关键“力-免疫轴”，深化了对针灸细胞机制及其在免疫相关疾病中调控炎症潜力的理解。

Graphical Abstract

CPTCs及其六个亚群构成大鼠AMF的主要细胞类型。其中Ptgs2⁺ CPTCs亚群能够响应机械刺激，在针刺刺激后增强与所有CPTC亚群的细胞粘附，随后通过Il6–Il6st–Stat3通路激活M2巨噬细胞，通过Il10分泌实现抗炎效应。

1 Introduction

针灸作为传统医学技术已在抗炎干预、细菌性痢疾管理等多种医疗场景中展现疗效。针灸针通常穿透皮下筋膜至大鼠皮下约3-4 mm深度，然而关于穴位处的直接细胞反应，特别是皮下筋膜内的细胞响应机制仍属未知领域。

筋膜系统是富含胶原蛋白的结缔组织网络，形成贯穿人体的连续基质。作为肌肉、骨骼、神经和内脏器官之间的结构桥梁，筋膜在力传递和伤口修复中起关键作用。皮下筋膜作为该系统的重要组成部分，在针灸中的潜在作用却被主要忽视。根据中医理论，AMF上的关元（CV4）、气海（CV6）和中脘（CV12）等穴位用于治疗细菌性痢疾、腹泻等多种疾病。

特络细胞（TCs）以其伸长形状和透射电镜下的超微结构特征为标志，是通过Cd34和Pdgfra表达标记的普遍间质细胞。先前研究主要关注不同器官中TCs的形态学鉴定，虽然对筋膜中TCs的存在进行了一些探讨，但这些研究主要局限于其形态分布。

为研究筋膜的主要细胞组成及其功能，我们对大鼠AMF进行单细胞测序并通过形态学分析验证结果。我们发现了CPTCs的一个亚群，特别是Ptgs2⁺ CPTCs对机械刺激产生响应。为进一步阐明该响应机制，我们对痢疾大鼠施行针刺（一种机械刺激形式），然后对痢疾组和针刺组的AMF进行单细胞测序和形态学分析，旨在阐明筋膜在免疫调控中的细胞机制及其潜在治疗意义。

2 Methods

2.1 Key Resources Table

详细列出了研究中使用的抗体、试剂、生物样本及引物信息，包括Cd34（Abclonal, A13929）、Pdgfra（Santa Cruz, sc-398206）、Il6（Abcam, Ab214429）、Ptgs2（Abcam, ab300668）等抗体的来源和标识号。

2.2 Data and Code Availability

本研究生成的scRNA测序数据集可通过NCBI获取，登录号见关键资源表，将在发表后公开。数据重新分析所需的更多细节或材料可通过联系通讯作者获取。

2.3 Experimental Animals and Ethical Approval

使用15只8周龄雌性SD大鼠（约250 g），实验方案经南京农业大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准（批准号：NJAU. No20220427087），遵循ARRIVE指南执行。

2.4 Bacterial Strains and Growth Conditions

2.5 Infection of Rats by S. typhimurium

2.6 Acupuncture Treatment

2.7 Sampling

2.8 Colony Counting

2.9 Hematoxylin and Eosin Staining

2.10 TUNEL Staining

2.11 Extraction and Culture of CPTCs

2.12 Transfection and Transwell Co-Culture

2.13 ELISA

2.14 RT-PCR

2.15 Western Blot

2.16 Immunofluorescence Staining

2.17 Transmission Electron Microscopy (TEM)

2.18 Tissue Dissociation and Cell Purification for scRNA

2.19 10× Library Preparation and Sequencing

2.20 Quantification and Statistical Analysis

包括scRNA数据分析、相关性分析、GO和KEGG分析、CellCall分析、pySCENIC分析、CytoTRACE分析等详细方法。

2.21 Deep Learning-Based Pipeline for Single-Cell Data Analysis

设计了用于scRNA-seq数据分析的深度学习流程，包括数据准备、神经网络架构、超参数优化、特征重要性评估和输出验证等步骤。

3 Results

3.1 CPTCs Are the Primary Component in Rat Abdominal Midline Fascia (AMF)

通过对mock组大鼠的scRNA-Seq分析，将11,116个细胞分为22个簇，最终鉴定出六种主要细胞类型。CPTCs占比27.8%，是筋膜中最多的细胞类型，其次是巨噬细胞（26.6%）、肌成纤维细胞（24%）、内皮细胞（13.1%）、淋巴细胞（7.9%）和其他细胞（0.6%）。免疫荧光（IF）显示CPTCs常在浅筋膜和支持带中聚集，透射电镜（TEM）观察显示CPTCs在皮下筋膜内平行排列，位于组织微通道（结缔组织胶原纤维束之间的间隙）内，表现出伸长细胞突触和细胞外囊泡分泌。

3.2 Ptgs2+ CPTCs Display Mechanosensitive Traits in Rat AMF

从单细胞测序数据中分离CPTCs并进行降维，通过无监督聚类方法得到六个 distinct亚群：Mrgprg⁺ CPTCs、Ptgs2⁺ CPTCs、Igfbp3⁺ CPTCs、Ccn5⁺ CPTCs、Ifi2712b⁺ CPTCs和Abca8a⁺ CPTCs。GO富集分析显示每个亚群具有 distinct主要功能，Ptgs2⁺ CPTCs在响应机械刺激方面表现出显著能力。IF观察到Ptgs2⁺ CPTCs在浅筋膜中平行聚集。pySCENIC分析显示Ptgs2⁺ CPTCs中具有高RSS的转录因子在“响应刺激”通路中显著富集。CellCall分析显示CPTC亚群间的主要配体信号接收者是Abca8a⁺ TCs和Igfbp3⁺ TCs，细胞间信号主要富集于细胞连接（包括粘着斑和粘附连接）。Monocle重建了从Igfbp3⁺ TCs到Mrgprg⁺ CPTCs的轨迹，Ptgs2⁺ CPTCs位于轨迹中间位置。基于伪时序表达模式将基因分为三组，与Ptgs2⁺ CPTCs高表达基因显著重叠的基因集在“细胞响应机械刺激”通路中富集。

3.3 Ptgs2+ CPTCs as Mechanosensitive Sentinels: Responding to Acupuncture and Enhancing Cell Adhesion With All CPTC Subpopulations

通过灌胃沙门氏菌成功建立大鼠痢疾模型，随后在AMF的CV4、CV6和CV12穴位进行针刺治疗。针刺干预有效减少了结肠和肝脏中的沙门氏菌菌落数，缓解了体重减轻。TUNEL和HE染色显示针刺治疗显著改善了结肠粘膜上皮细胞坏死和上皮充血。TEM显示随着痢疾进展，AMF组织微通道中CPTCs数量显著减少，无细胞间连接；针刺治疗后，CPTCs表现出更长的telopodes，同型细胞间连接显著增加。从痢疾组和针刺组筋膜的single-cell测序数据中分离CPTCs，降维和重聚类后得到六个 distinct亚群，针刺治疗后Ptgs2⁺ CPTCs比例显著增加。CytoTRACE分析显示针刺后Ptgs2⁺ CPTCs在所有CPTC亚群中分化状态最低，干细胞样特征最强。应用深度学习技术识别出CPTCs中针刺相关基因集，GSEA显示“响应机械刺激”通路具有最高NES。六个CPTC亚群标记基因的GO分析显示针刺后Ptgs2⁺ CPTCs在“响应机械刺激”通路中表现出最高NES和显著性。细胞信号分析显示针刺后CPTC亚群间通信模式发生显著转变，痢疾期间Ccn5⁺ CPTCs和Ifi27l2b⁺ CPTCs是主要配体信号接收者，而针刺后Ptgs2⁺ CPTCs成为主要接收者。通路活性分析显示针刺后细胞粘附通路富集，表明针刺重新配置了CPTCs间的细胞-细胞相互作用，Ptgs2⁺ CPTCs作为中心枢纽。使用NicheNet识别出痢疾组和针刺组细胞通信中主要差异配体和相应靶基因，这些激活靶基因的GO富集分析显示它们在增强Ptgs2⁺ CPTCs对针刺刺激响应性中的关键作用。

3.4 Ptgs2+ CPTCs Bridge Acupuncture Stimulation to M2 Macrophage Anti-Inflammation via Il6-Il6st-Stat3

关注巨噬细胞——关键的抗炎细胞和AMF中第二丰富的亚群。通过Ptpr和Itgam表达鉴定髓系细胞，通过Cd68⁺Itgax^-表达区分巨噬细胞。对大鼠AMF单细胞数据中的巨噬细胞进行降维和重聚类，根据Cd86和Cd163表达鉴定出M1、M2和其他亚群。三组间巨噬细胞群体比较分析显示痢疾大鼠中M1巨噬细胞增加，而针刺显著提高了M2巨噬细胞比例。TEM分析显示针刺后M2巨噬细胞伸出更长更多伪足。Monocle轨迹分析显示针刺后M1向M2转变增强，分支增加。通过深度学习识别出M1和M2巨噬细胞中针刺相关基因集，GSEA显示Il17、TNF和NF-κB通路在M1和M2亚群中激活。显著的是，针刺刺激M2巨噬细胞分泌抗炎细胞因子Il10。为研究CPTCs和巨噬细胞间的相互关系，进行CellCall分析比较针刺组Ptgs2⁺ CPTCs与痢疾组Ccn5⁺和Igfbp8⁺ CPTCs及其相应M2巨噬细胞。分析显示在所有互连信号中，Il6是Ptgs2⁺ CPTCs中独特表达的 signaling分子，仅在针刺组中检测到，在所有其他细胞类型和条件（包括痢疾大鼠）中缺失。IF进一步证实Il6表达在针刺组中特异性位于Ptgs2⁺ CPTCs。随后，Ptgs2⁺ CPTCs通过Il6st将Il6传递至M2巨噬细胞，激活Stat3（在痢疾大鼠中无活性）。为辨别针刺诱导的细胞因子表达反映的是局部还是全身响应，通过ELISA定量血清Il6和Il10水平，有效排除了观察到的细胞因子改变源自全身炎症响应（如细菌感染引发）的可能性。通过蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，描绘了Il6、Il6st、Il10和Stat3间的相互作用。将过表达Il6的CPTCs与M2巨噬细胞体外共培养，IF显示过表达后Il6分泌显著增加，ELISA进一步证实细胞上清液中Il6水平升高。此外，共培养M2巨噬细胞的qPCR分析显示Il6过表达CPTCs显著上调了M2巨噬细胞中Stat3和Il10的表达。Western blot分析显示与Il6过表达Ptgs2⁺ CPTCs共培养的M2巨噬细胞中Stat3酪氨酸705位点磷酸化显著增加，而总Stat3蛋白水平不变。

4 Discussion

4.1 CPTCs Constituted the Predominant Cell Population in Rat AMF

认识到阐明皮下筋膜功能和细胞组成的证据有限，我们对大鼠AMF细胞进行单细胞分析以获得全局视图。研究发现CPTCs是AMF的主要组成部分，其次是巨噬细胞和肌成纤维细胞，从而推进了对筋膜细胞多样性的理解。证据表明CPTCs在不同解剖位置表现出异质性，我们在皮下筋膜中也观察到这一现象。具体而言，我们的分析鉴定出六个 distinct CPTC亚群， resulting in a comprehensive cellular atlas of CPTCs in the rat AMF。该图谱为描述CPTC亚群的功能作用提供了关键框架，填补了我们对皮下筋膜理解的关键空白，为临床和治疗探索提供了新机会。

4.2 Ptgs2+ CPTCs Is a Stimulus–Response Hub in Rat AMF

关于CPTCs的研究主要集中于它们在建立细胞连接和促进长距离细胞间通信的作用。虽然一些研究强调了子宫TCs对激光刺激的响应性，但对TCs响应物理刺激的更广泛理解仍未充分探索。在本研究中，我们鉴定了一个 distinct CPTC亚群——Ptgs2⁺ CPTCs，在大鼠AMF中表现出显著的机械敏感特性。此外，我们通过多种分析方法证实了这一潜力，包括GO富集、TF RSS活性分析和轨迹分析。

针灸是一种通过机械刺激治疗疾病的独特治疗方法。在痢疾大鼠AMF进行针刺治疗后，Ptgs2⁺ CPTCs表现出明显的响应性，表现为“响应机械刺激”通路的激活、增强的细胞通信、细胞群体的增殖和telopodes的伸长。此外，在针刺机械刺激后，Ptgs2⁺ CPTCs与所有CPTC亚群建立增强的细胞粘附。这为了解CPTCs增强的连接性提供了更全面的理解，并有助于解释针刺诱导的细胞响应。

此外，发现Ptgs2⁺ CPTCs在针刺后在所有CPTC亚群中具有最高的CytoTRACE分数，表明其分化状态较低且干细胞样潜力较强。这些发现表明Ptgs2⁺ CPTCs代表了一个具有内在可塑性和自我更新能力的机械响应亚群。与此一致的是，我们观察到针刺后Ptgs2⁺ CPTCs比例显著增加。我们将此扩张解释为它们通过自我激活和增殖响应机械刺激的内在能力。

4.3 Ptgs2+ TCs Act as “Force-Immune Axis” Bridging Acupuncture Stimulation to M2 Macrophage Anti-Inflammation

巨噬细胞是大鼠AMF中第二多的细胞。巨噬细胞对环境线索表现出多样的功能响应，M1巨噬细胞分泌促炎细胞因子，而M2巨噬细胞释放抗炎介质，包括 interleukin-10 (Il10)。Il6是巨噬细胞激活的关键调节因子，其缺乏会导致细胞凋亡增加和炎症加剧。它选择性驱动M2巨噬细胞激活，从而促进抗炎和免疫调节响应。此外，Il6刺激Il10的产生，而Stat3在放大Il10的抗炎效应中起关键作用。

我们的研究得出结论，针刺增加了M2巨噬细胞的比例并激活了它们的抗炎响应。这与先前发现一致，即针刺刺激激活免疫响应并使巨噬细胞分化。然而，连接机械刺激与免疫调控的具体通路是一个未被发现的“黑箱”，也被称为“经络”。几种假设表明经络可能等同于血管、肥大细胞或神经。然而，这些假设存在根本缺陷。它们类似于“碎片化的桥梁”，无法同时连接两岸。要么它们无法响应针刺刺激而不引起疼痛，要么它们确实响应但缺乏整体生理效应所必需的下游调控功能。

幸运的是，我们鉴定出Ptgs2⁺ CPTCs作为“力-免疫轴”连接针刺刺激与M2抗炎。一方面，Ptgs2⁺ CPTCs对针刺刺激表现出强烈响应。更重要的是，它们在调节M2抗炎响应中起关键作用。通过分泌Il6，Ptgs2⁺ CPTCs激活M2中Stat3的转录活性，最终促使M2分泌Il10，从而发挥抗炎作用。值得注意的是，Il6仅在响应针刺的Ptgs2⁺ CPTCs中表达，在任何其他细胞亚群中未检测到Il6。我们计算了其他几种细胞群体在针刺前后的差异表达基因和富集通路，以排除它们直接响应针刺的可能性。

几项研究报告称，各种细胞类型的机械拉伸可诱导Il6转录和分泌。在我们的研究中，我们观察到Ptgs2⁺ CPTCs在针刺后会分泌Il6。鉴于Ptgs2⁺ CPTCs与筋膜中胶原纤维的密切解剖关联，以及针刺操作（如提插或捻转）可物理位移和拉伸胶原纤维，Ptgs2⁺ CPTCs很可能是通过胶原介导的张力被机械刺激，最终导致Il6上调。该机制可能代表针灸触发免疫调节级联的早期事件。需要进一步研究以阐明所涉及的具体信号机制。

先前研究表明，针灸可显著降低血清中Il6表达水平并激活巨噬细胞。有趣的是，我们的研究结果表明针刺刺激导致筋膜中Ptgs2⁺ CPTCs局部Il6表达增加。空间受限的Il6 signaling可发挥 distinct免疫调节作用，其中局部Il6促进再生或抗炎表型，而全身Il6与促炎状态相关。我们相信Ptgs2⁺ CPTCs将以旁分泌方式激活邻近巨噬细胞并通过Il6–Il6st–Stat3促进M2极化。相比之下，针刺后细菌负荷和炎症的减少可能有助于全身Il6的下调，反映了全身炎症的消退。未来采用遗传或药理学抑制Il6 signaling的研究对于建立因果关系至关重要。

总之，我们的研究确定Ptgs2⁺ CPTCs作为连接针刺机械刺激与免疫调控的关键介质。通过证明它们在通过Il6-Il6st-Stat3通路增强M2巨噬细胞抗炎响应中的作用，我们为针灸治疗效应的细胞机制提供了新的见解。这项工作不仅加强了针灸在现代医学中的相关性，而且突出了Ptgs2⁺ CPTCs作为调节炎症和免疫响应的潜在治疗靶点。将传统治疗实践与分子机制联系起来，为基于针灸的免疫调节疗法开辟了新途径。

5 Summary

CPTCs及其六个亚群构成大鼠AMF的主要细胞类型。其中Ptgs2⁺ CPTCs亚群能够响应机械刺激，在针刺刺激后增强与所有CPTC亚群的细胞粘附，随后通过Il6–Il6st–Stat3通路激活M2巨噬细胞，通过Il10分泌实现抗炎目的。

Author Contributions

概念化：Q.C., Z.Z.；方法学：Z.Z., H.H., J.Y.；验证：Z.Z.；数据管理：Z.Z., H.H.；形式分析：Z.Z., H.H., Y.S.；调查：Z.Z., H.H., J.Y., X.Z., Y.S., B.S., Q.Z.和L.M.；资源：Q.C.；初稿撰写：Z.Z.；审阅编辑：Z.Z., Q.C.；可视化：Z.Z., H.H.；监督：Q.C.；项目管理：Q.C.。

Acknowledgments

感谢南京农业大学刘永杰教授提供沙门氏菌CVCC542菌株。感谢Bill Holt教授润色稿件。感谢南京农业大学耿金珠博士、黄浩博士和陈源博士的免疫学指导。感谢李梦烨在动物建模和解剖方面的指导。本研究得到国家自然科学基金（资助号31872433）支持。

Conflicts of Interest

作者声明无利益冲突。