番茄双泛素激活酶E1（SlUBA1/SlUBA2）通过差异调控E2充电效率在植物免疫与发育中发挥不对称功能

本研究发现番茄（Solanum lycopersicum）中两种泛素激活酶（E1）SlUBA1和SlUBA2通过差异调控E2酶充电效率（E2 charging），形成双泛素激活系统（DUAS）。SlUBA2特异性高效激活IV、V、VI和XII组E2酶（如SlUBC32/33/34），其C端泛素折叠结构域（UFD）中Gln1009残基和E2特有的13氨基酸插入序列共同决定充电特异性。基因沉默实验证实SlUBA2缺失显著削弱植物对Pseudomonas syringae pv. tomato（Pst）的免疫能力，揭示植物E1通过差异化E2充电精密调控免疫通路的新机制。

　　

1 引言

泛素化作为一种关键的蛋白质翻译后修饰（PTM），在植物免疫应答中发挥核心作用。该过程由泛素激活酶（E1或UBA）、泛素结合酶（E2或UBC）和泛素连接酶（E3）共同催化完成。E1酶处于泛素化级联反应的顶端，通过ATP水解激活泛素分子，形成E1~泛素硫酯中间体，并将活化的泛素转移至特定E2酶（称为E2充电）。尽管植物基因组通常编码多个E1同源酶，但它们的功能分化机制长期以来未被阐明。前期研究表明烟草（Nicotiana tabacum）中两个E1基因受病毒侵染和防御激素诱导表达，而拟南芥E1酶在疾病抗性中表现出功能差异，但其分子基础尚未解析。

2 结果

2.1 番茄和本氏烟基因组编码多个泛素E1酶

番茄基因组中存在两个编码典型E1结构域（腺苷化结构域、Cys结构域和泛素折叠结构域UFD）的基因SlUBA1（Solyc06g007320）和SlUBA2（Solyc09g018450），分子量均为110 kDa。体外硫酯实验证明两者均能催化番茄E2酶SlUBC3形成泛素加合物。四倍体植物本氏烟（Nicotiana benthamiana）则编码四个E1同源酶：与SlUBA1高度同源的NbUBA1a/1b（90.95%/90.16%一致性）和与SlUBA2高度同源的NbUBA2a/2b（90.86%/90.89%一致性）。系统发育分析确认了这些E1酶的进化关系，且植物中不存在人类UBA6同源物。

组织表达分析显示SlUBA1和SlUBA2在番茄根、茎、叶、萼片、花瓣、子房和果实中均有表达，其中SlUBA1在萼片和子房中表达显著升高，而SlUBA2在果实中表达较低。亚细胞定位表明两个E1蛋白同时存在于细胞核和细胞质中，符合泛素化作用的广泛性特征。

2.2 SlUBA1和SlUBA2在植物发育中的差异化作用

通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术特异性沉默番茄和本氏烟中的E1基因，发现SlUBA1/NbUBA1a/b沉默导致植株矮化、节间缩短、主根变短和侧根减少；而SlUBA2/NbUBA2a/b沉默植株虽保持正常高度，但出现主根缩短、侧根显著减少和叶片窄小表型。双基因沉默引起严重生长缺陷、快速黄化和5-7周内死亡，表明E1功能冗余对植物发育至关重要。生物量统计显示沉默植株的整体生物量、茎根生物量和茎长均显著降低，叶片面积也明显减小。

2.3 SlUBA1和SlUBA2在植物免疫中的不对称功能

flg22处理诱导SlUBA1和SlUBA2表达上调，提示其参与免疫应答。在本氏烟中进行细胞死亡抑制试验（CDSA）发现，NbUBA2a/b沉默导致PAMP触发免疫（PTI）介导的细胞死亡抑制能力受损，而NbUBA1a/b沉默无此效应。细菌生长试验进一步证实：SlUBA2沉默番茄中Pst DC3000ΔhrcQ-U的生长显著增强，本氏烟中Pst DC3000ΔhopQ1-1的生长也在NbUBA2a/b沉默植株中显著增加。根据沉默强度分组的实验显示，UBA2沉默程度与病原菌生长正相关，证实UBA2在免疫中的主导作用。

2.4 番茄E1酶对四组E2的差异化充电

体外硫酯实验检测34个番茄E2酶的充电效率，发现SlUBA2对IV组（SlUBC32/33/34）、V组（SlUBC7/14/35/36）、VI组（SlUBC4/5/6/15）和XII组（SlUBC22）E2的充电效率显著高于SlUBA1。这些差异充电的E2与人类UBE1/UBA6差异化充电的E2属于同一进化枝，提示植物中存在与动物相似的双E1激活系统（DUAS）。

2.5 E1的UFD结构域决定E2充电特异性

通过构建SlUBA1和SlUBA2的UFD结构域互换嵌合体（SlUBA1-UFD^SlUBA2和SlUBA2-UFD^SlUBA1），发现UFD互换可逆转两者对IV组和V组E2的充电偏好性，证明UFD是决定E2充电特异性的关键因素。但嵌合体充电效率仍略低于野生型，提示UFD并非唯一决定因素。

2.6 SlUBA2的Gln¹⁰⁰⁹残基调控充电特异性

序列比对发现SlUBA2 UFD中的Gln¹⁰⁰⁹Asn¹⁰¹⁰是植物E1中变异显著的连续残基。点突变实验显示SlUBA2^Q1009A突变体对SlUBC7和SlUBC12的充电效率大幅降低，而SlUBA2^Q1009K仅轻微降低，表明Gln¹⁰⁰⁹的酰胺侧链对维持充电活性至关重要。该残基位于UFD第一个α螺旋末端，可能通过调控构象变化影响E1-E2硫酯转移。

2.7 E2特有结构特征影响充电特异性

V组E2均含有13氨基酸插入序列（位于UBC结构域第四β链与第二α螺旋之间的环区）。缺失该序列的SlUBC7^Δ13aa突变体被SlUBA1充电的效率提高，而被SlUBA2充电的效率降低；相反，在SlUBC12中插入该序列（SlUBC12^+13aa）则使其获得SlUBA2偏好性。证明该插入序列通过改变E2构象影响E1识别效率。

2.8 SlUBA2与IV组E2存在更强体内互作

共免疫沉淀（Co-IP）、双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）实验一致显示SlUBA2与SlUBC32/33/34的相互作用强度显著高于SlUBA1。在本氏烟中沉默NbUBA2a/b几乎完全抑制IV组E2的体内充电，而沉默NbUBA1a/b无影响，证实SlUBA2是IV组E2的主要激活酶。

2.9 拟南芥E1同源酶存在相似差异化充电

拟南芥E1酶AtUBA1和AtUBA2对AtUBC32/33/34表现出差异化充电，AtUBA1充电效率显著更高。跨物种实验显示拟南芥E1对番茄SlUBC32同样存在充电差异，表明双E1激活系统在植物中具有保守性。

3 讨论

本研究揭示番茄通过SlUBA1和SlUBA2构成双泛素激活系统（DUAS），通过差异化充电IV、V、VI和XII组E2酶实现免疫功能分工。SlUBA2高效充电免疫相关E2（如IV组E2），其缺失导致PTI能力受损；而SlUBA1沉默可通过SlUBA2补偿维持免疫稳态。UFD结构域中Gln¹⁰⁰⁹残基和E2特有13氨基酸插入序列共同决定充电特异性。

植物E1酶可能通过翻译后修饰（如磷酸化、S-谷胱甘肽化）和亚细胞定位等机制进一步精细化调控充电效率。多数植物基因组编码多个E1同源酶的现象表明，DUAS可能通过时空分离或并行作用的方式为泛素化调控提供冗余性和特异性。靶向鉴定差异化充电的E2及其对应E3酶，将为了解泛素化如何精密调控植物免疫提供新视角。

4 实验方法

实验采用番茄RG-pto11和本氏烟为材料，通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的VIGS技术进行基因沉默。重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达并纯化，硫酯 assay 检测E2充电效率。蛋白互作通过Co-IP、BiFC和Y2H验证。病原菌生长 assay 使用Pst DC3000衍生菌株，PTI分析采用Pseudomonas fluorescens 55诱导。基因表达通过RT-qPCR检测，引物列表见附表S3。